大学研究生专业实验教学实验报告书.doc

重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称：细胞力学加载实验技术实验指导教师：吕 永 钢学 院： 生物工程学院专业及类别： 生物医学工程（学术型）学 号：20131902047姓 名：刘 玥实验日期：2014.3.27成 绩：重庆大学研究生院制一、 实验目的 学习细胞力学加载的基本原理及相关知识 熟悉Flexercell-4000操作流程和注意事项二、 实验仪器设备材料：培养瓶，试管，移液管，废液缸，75酒精棉球，酒精灯，前交叉韧带（ACL）细胞。仪器：Flexercell-4000 基底加载装置，C02培养箱，倒置显微镜，超净台，恒温水浴锅，4冰箱。试剂：DMEM培养基，小牛血清或胎牛血清，0.25胰蛋白酶，PBS缓冲液。三、 实验原理（1）基底形变加载技术基底形变加载技术是用弹性膜作为基底材料，通过机械拉伸或利用气压，液压和机械接触引起弹性底面的形变，通过对基底材料加载后使基底材料的应变传递到细胞上,使附着于该底面的细胞受到牵引力，并可附加一些调节力周期的机械装置。通过该方式可产生循环或静止的单轴拉伸、循环或静止的双轴拉伸、循环或静止的等双轴拉伸。（2）Flexercell-4000的实验原理Flexercell-4000 基底加载装置，本实验采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置（Flexercell-4000 tension），图1为其结构简图该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜，形成负压而使培养膜产生拉伸应变，从而使黏附生长的细胞受到张力的作用。细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率（%），整个加载装置放置于CO2孵箱内，加载程序由Flexercell-4000计算机软件自动控制。 Flexercell 4000柔性基底拉伸系统的组成： Flexercell-4000软件的计算机控制器（FlexCentral） 负压输出控制（FlexLink），真空源负压泵 真空基底板（BasePlate and Gasket），密封垫，加载平台 BioFlex培养板 BioFlex培养板为一次性，六孔板硅胶膜上均包被有不同的蛋白质或氨基酸。如胶原蛋白（collagen），弹性蛋白（elastin）等图1 Flexercell-4000简易结构图该系统用真空负压对生长中的细胞（组织）进行加载，加控制的静力或动力循环使膜变形，从而是贴在膜上生长的细胞（组织）也发生相应的变形，诱发细胞(组织)发生生物学变化。当只有BioFlex培养板时，基膜最大伸长可达到30%，有BioFlex培养板和加载台时，基膜的伸长可过20%。可以使用Flexercell拉伸加载系统进行试验的细胞或组织有很多，例如：肌肉、心肌、血管、肌腱、韧带、骨和软骨等。Flexercell-4000柔性基底拉伸系统由Flexercell-4000计算机软件自动控制，用于施加不同的刺激参数。可设置的参数如下：1.培养板膜的最小和最大伸长率（0-30%）2.频率3.加载波形：静力加载、正选波、心形波、三角波、方波和自定义波形四、 实验内容1人无菌室之前用肥皂洗手，用75酒精擦拭消毒双手。2超净台台面应整洁，用0.1新洁尔灭溶液擦净。 4打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右。5将类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞接种于Flexercell-4000 基底加载装置特用的六孔板上，把六孔板置入Flexercell-4000配套的CO2培养箱进行培养，于孵箱内培养48h。6加载前将培养板中的旧液换成2%低血清新鲜培养液。每孔随机取点拍照。7在Flexcercell 4000软件上选择参数，参数如下：正弦波，min：0，max：12%,time:12h。8打开缓冲泵后，打开真空泵，然后启动加载。9加载结束后，关闭充气泵，再关缓冲泵，然后关闭电脑。10卸载后继续培养24h，每孔再随机取点拍照。具体设备使用步骤：1）、开启应力加载控制器、开启电脑2）、开启FlexSoft FX-4000 软件，命名和设置参数 3）、将培养有细胞的细胞培养板放在应力加载平台上，盖紧，关闭培养箱。4）、打开气体阀门装置。先开泵管，再开阀门5）、点击“start”，运行软件6）、运行软件过程中，若实时参数与预设参数有误差，点击“stop”，将培养箱中的细胞培养板和应力加载平台尽可能盖紧，再运行软件。7）、运行结束后，关闭气体阀门装置，先关闭阀门，再关闭泵管开关，关闭应力加载控制器，最后关闭电脑注意事项：1）、开启和关闭气体阀门装置时，注意顺序。防止装置损坏或发生意外2）、将细胞培养板和应力加载平台要尽量盖紧，不留缝隙，以减少误差五、 实验数据实验结果如下图所示：图2 未加载ACL形态图3 12%静态加载6h后ACL形态六、 数据处理及结果分析如图2、3所示：图2是没进行处理的细胞状态，图3是在12%拉伸状态下处理6h的状态。前交叉韧带（ACL）细胞成纤维样滑膜细胞。其在受到力学加载前，细胞成梭形，与成纤维细胞相似；加载力后细胞比加力前更为铺展，形态细长细胞密度增大。此结果可以说明前交叉韧带（ACL）细胞在经历了长时间的力学拉伸后或发生形态上的巨大变化，说明了力学拉伸对细胞的生长发育起着重要的作用，因此在研究中应该考虑机械应力对细胞的影响。七、 实验小结细胞力学是现代生物力学近几年来发展十分迅速的一个前沿领域，也是组织工程学的一个重要组成部分。由于体内环境异常复杂，细胞的体外分离和培养技术是研究细胞生理、病理现象的一种重要手段，也是生物力学中迅速发展起来的前沿领域和目前细胞力学研究的重要方法。本实验通过对前交叉韧带（ACL）细胞进行拉伸等力学实验，说明了力学对细胞生长发育的影响。因此，在研究中应注意不同力学环境下对细胞的影响。在该试验过程中，应注意以下事项，防止影响该试验：1).整个操作过程要保证无菌操作。2).力学加载时，每个培养孔中的液体要适量，避免太少或太多，以3-4ml为宜。3).加载前应在Flexcercell真空基底板与密封垫接触以及加载平台上涂抹适量的乳胶，以保持良好的密封性。4).随时观察真空泵的温度，并采取一定降温措施，以防过烫。5).使用Flexercell-4000时，应先开电脑，再启动FX-4000的操作系统。应先等系统稳定时才可以进行试验，可通过仪器声音来判断，声音由大变小，说明启动成功，可进行实验。6).拉伸前，应先开启缓冲泵后，在开启充气泵；加载结束后，应先关充气泵，喉管缓冲泵。以防止损坏机器。