生物医用材料生物相容性及其评价方法课件.ppt

生物医用材料生物相容性及其评价方法,生物相容性概念,生物相容性是生物医用材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理、化学反应的一种概念。生物相容性是生物材料研究中始终贯穿的主题。按ISO会议的解释:生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能。一般是指材料与宿主之间的相容性,包括组织相容性和血液相容性。,换言之：植入人体内的生物医用材料及各种人工器官、医用辅助装置等医疗器械，必须对人体无毒性、无致敏性、无刺激性、无遗传毒性和无致癌性，对人体组织、血液、免疫等系统不产生不良反应。,生物相容性两大原则,生物安全性原则 生物功能性原则,生物安全性原则,生物安全性原则 目的在于消除生物材料对人体器官的破坏性,比如细胞毒性和致癌性生物材料对于宿主是异物在体内必定会产生某种应答或出现排异现象。生物材料如果要成功至少要使发生的反应被宿主接受，不产生有害作用。因此要对生物材料进行生物安全性评价，即生物学评价。,生物功能性原则,是指其在特殊应用中“能够激发宿主恰当地应答”的能力。随着对生物材料生物相容性的深入研究，人们发现不仅要对生物材料的毒副作用要进行评价，还要进一步评价生物材料对生物功能的影响。,生物相容性反应,生物学反应材料反应,生物学反应,血液反应免疫反应组织反应,血液反应,血小板血栓凝血系统激活纤溶系统激活溶血反应白细胞反应细胞因子反应蛋白黏附,免疫反应,补体系统激活体液免疫反应细胞免疫反应,组织反应,炎症反应细胞黏附细胞增值形成囊膜细胞质的转变,材料反应,物理性质变化化学性质变化,引起生物医用材料变化的因素,生理活动中骨骼、关节、肌肉的力学性动态运动；细胞生物电、磁场和电解、氧化作用；新陈代谢过程中生物化学和酶催化反应；细胞黏附吞噬作用；体液中各种酶、细胞因子、蛋白质、氨基酸、多肽、自由基对材料的生物降解作用。,引起生物体反应的因素,材料中残留有毒性的低分子物质；材料聚合过程残留有毒性、刺激性的单体；材料及制品在灭菌过程中吸附了化学毒剂和高温引发的裂解产物；材料和制品的形状、大小、表面光滑程度；材料的酸碱度,生物相容性分类,血液相容性组织相容性（一般生物相容性）,血液相容性：材料用于心血管系统与血液直接接触，主要考察与血液的相互作用；组织相容性：材料与心血管系统外的组织和器官接触，主要考察与组织的相互作用。,血液相容性要求,抗血小板血栓形成；抗凝血性；抗溶血性；抗白细胞减少性；抗补体系统抗进性；抗血浆蛋白吸附性；抗细胞因子吸附性.,组织相容性要求,细胞黏附性；无抑制细胞生长性；细胞激活性；抗细胞原生质变化性；抗炎症性；无抗原性；无诱变性；无致癌性；无致畸性。,组织相容性的两个问题：生物医用材料与炎症；生物医用材料与肿瘤。血液相容性的两个问题：生物医用材料与血小板；生物医用材料与补体系统。,非感染性炎症：由于植入物中微量小分子物质渗出，刺激组织所引起的炎症反应；感染性炎症：生物医用材料和医用装置植入人体内后，由于植入物灭菌不彻底或植入被污染的无菌材料而引起的并发症。,生物医用材料与炎症,植入手术过程中对皮肤或组织造成损伤，给微生物提供侵入体内组织的机会；植入生产过程中已被细菌污染的材料和制品或无菌材料已被污染；植入材料能抑制体内的抗炎防御系统的反应性，增加了局部组织易感染性；植入材料能抑制和吸附补体C3a、C5a，增加了多核白细胞在植入局部组织中的数量，使抑制局部炎症反应的能力减弱。,造成细菌性感染的原因有以下几点：,生物医用材料与肿瘤,诱发肿瘤的可能因素：与植入材料的外形有明显的相关性；与植入材料的埋植方法有关；与植入材料表面的粗糙程度有关；被致癌物污染的材料或生物老化时能释放致癌物质的材料，在植入动物体内能诱发恶性肿瘤；与植入材料在体内形成的纤维包膜厚度有关；材料中残留的有毒性或有刺激性的小分子物质使局部组织长期受毒或受刺激，可诱发恶性肿瘤。,生物医用材料与血小板,生物医用材料对血小板的黏附。激活引起的一系列凝血核纤溶系统的反应，形成血小板血栓，其中血小板纤维连接蛋白参与血小板胶原的黏附，增强了血小板的伸展作用，加速血栓的形成；血小板因子V能促进凝血酶的局部生成，加速凝血过程。,生物医用材料与补体系统,补体是血液中的一群蛋白质，在机体抵御感染中起重要作用。补体活化：补体各成分按一定顺序呈链锁的酶促反应。补体系统激活的两条途径：经典激活途径；旁路激活途径（替代途径）。,补体激活对机体产生的影响,C3a、C5a被称为过敏素，可引起患者过敏症状在透析时观察到患者有血氧下降或低血压现象C3b将引起白细胞在材料表面黏附，通过释放血小板激活因子促进血小板聚集，参与血栓的形成出现慢性并发症植入物的表面黏附大量的白细胞,生物医用材料的生物相容性评价,生物医用材料的安全性从广义上讲应该包括物理性能、化学性能、生物学性能及临床研究等四个方面；从狭义上讲是指生物学评价。,生物学评价项目的选择,不同用途的生物医用材料和医疗器械的生物学评价项目的内容和水平都不相同。具体如下：接触部位有体表和体内组织、骨骼、牙、血液；接触方式有直接接触和间接接触；接触时间是：暂时接触不大于24h,短、中期接触长于24h至30日，长期接触长于30日；用途：一般功能、生殖与胚胎发育及生物降解。,生物材料生物学评价标准的发展,1982年美国国家标准学会和牙科协会(ANSI/ADA)公布了评价生物相容性实验标准草案。国际标准化组织(ISO)于1997年 以10993 编号发布了17 个相关标准。我国全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会成功将ISO10993系列标准转化为国家标准医疗器械生物学评价,生物学评价标准,美国ASTM(F748-82)标准；美、英、加拿大三国标准；ISO生物学评价标准；我国生物学评价试验选择标准。,ISO生物学评价标准,ISO10993的总题目是医疗装置生物学评价，由下列部分组成：第1部分试验选择指南；第2部分动物福利要求；第3部分遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验；第4部分与血液相互作用试验选择；第5部分细胞毒性试验，体外法；第6部分植入后局部反应试验；第7部分环氧乙烷灭菌残留；第8部分临床调查；第9部分与生物学试验有关的材料降解（技术报告）；第10部分刺激与致敏试验；第11部分全身毒性试验；第12部分样品制备与标准样品。,ISO生物学评价标准特点,明确了医疗装置的分类，将接触部位分为表面接触、体外与体内接触、体内植入三大类；在接触时间上将小于24h的接触列为一时接触，短、中期接触时间大于24h至30天，30天以上为长期接触；将生物学评价试验分为基本评价试验和补充评价试验两大类；将亚慢性、亚急性毒性试验列入基本评价试验项目中，取消了热原试验项目；在补充评价试验中增加了生殖与发育毒性和生物降解试验两个项目。,我国生物学评价标准与国际标准的不同,将热原试验列为基本评价的生物学评价试验；将溶血试验列为一项生物学评价试验；将亚急性（亚慢性）毒性试验列入补充评价部分。,生物学评价试验特点,大部分体内、外生物学试验检测样品用材料浸提液，用121摄氏度生理盐水60min浸提进行试验；直接用材料和医疗器械植入体内，与组织、血液或体表组织、血液接触进行试验；大部分的体内试验是通过外科无菌手术操作方式进行的；进行体外细胞培养，观察样品的细胞毒性，测定浸提液或材料对细胞溶解（细胞死亡）、抑制生长的毒性作用；,致癌试验是用不同形状、大小、表面状态的材料植入体内某一部位，观察动物整个寿命期材料和医疗器械对体内潜在的致癌作用；血液相容性试验是通过材料和医疗器械直接接触血液，首先观察对血小板激活、血栓形成的凝血作用，其次观察血浆蛋白、血液由形成分和补体系统、细胞因子的作用；植入试验是将生物材料和医疗器械埋入动物体内某些部位，断肠埋入不同时间材料对局部的组织病理学的改变；降解试验是采用各种体内外方法，测定材料和医疗器械的降解程度、力学强度的变化，了解降解产物在体内的吸收、分布、代谢过程，评价材料对机体的有害作用。,生物相容性评估趋势,整体动物,细胞水平,分子水平,生物相容性评估发展,体内植入,体外细胞毒性实验,生物相容性评估发展趋势,形态，数量,功能,形态，数量,光学显微镜,形态，数量,电子扫描显微镜（SEM）,形态，数量,相差显微镜,功能,四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT 法）荧光染色法 流式细胞光度术（Flow cytometry,FCM）放射性同位素摄入法,四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法,1983年Mosroam提出，是测定细胞的代谢功能原理：线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。特点：形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。缺点：该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。,将细胞与乙酰乙酸荧光素(FDA)和溴化乙锭(EB)一起培养,FDA能够进入细胞内部并转化为荧光素,荧光素,在适当的激发波长下发出绿色荧光。EB不能穿过完整的细胞膜,但如果细胞膜已经被破坏,EB就能够进入细胞并且与核酸尤其是细胞核内的DNA 紧密结合,这时看到的是橘红或红色的荧光。,荧光染色法,荧光染色法,原理：是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。特点：在荧光显微镜下迅速区分受损细胞该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。,流式细胞光度术 Flowcytometry,FCM,原理：该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光，检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。特点：FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸，蛋白质、酶、细胞周期分布等进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。,放射性同位素摄入法,原理：在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成情况。特点：揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段 缺点：同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备。,其他功能,细胞粘附细胞散布细胞生物合成功能,对细胞功能影响的分子生物学评价,细胞粘附分子(CAM)细胞因子和生长因子 DNA转录翻译与信号传导,细胞粘附分子(CAM),细胞粘附分子(CAM)家族，它是一类表达在细胞表面的分子，能够控制和促进细胞与其他细胞(比如基质中的细胞)的相互作用。,细胞因子和生长因子,细胞因子是能够被多种细胞所分泌的调节免疫反应和炎症反应的重要物质，即能活化也能抑制某些生物过程，在宿主对植人材料的应答反应中起核心的控制作用。,DNA转录翻译与信号传导,DNA转录翻译与信号传导 MMPs(matrix metalloproteinMes)作为细胞外差质中的非胶原蛋白日益受到人们的高度重视，它是一类在正常组织分化和重塑过程中负责降解细胞外差质如胶原和糖蛋白的重要含锌酶，在组织重塑的各个阶段尤其是新组织合成之前，MMPs对细胞外差质的降解非常重要。,血液相容性评价方法,导言血液相容性的定义血液相容性的评价方法基本评价方法细胞水平评价评价指标实验方法数据处理方法展望,导言,应用的增多心血管系统的生物材料人工脏器 血液组份与材料表面的相互作用及后续反应的复杂性生物体的生理机能差异 生物材料的应用环境差异,血液相容性的定义,抗凝血能力抑制血管内血液形成血栓 不损伤血液成分 溶血现象(红细胞破坏)、血小板功能降低、白细胞暂时性减少功能下降以及补体激活 无免疫反应酶的活性电解质浓度、渗透压,血液相容性的评价方法,发展史六十年代初，美国国立卫生研究院(NIH)l985年，NIH，“血液与材料相互作用指南”目前，109934 标准具体评价方法和指标都未统一，更没有标准化。,基本评价方法,体外法用人或动物离体血与受检的生物材料按某种方式接触一定时间后，测定血液成分变化或检查材料上血液成分及数量 平行板流动室系统 半体内法从活体动物或在心脏手术时建立的体外循环中，从心血管系统直接使血液与材料接触 体内法利用静脉腔内放置材料环观察血栓形成状况,细胞水平评价,血小板血浆蛋白内皮细胞白细胞细胞因子粘附因子组织因子,评价指标,溶血率、动态凝血时间血小板消耗率，粘附数量、活性纤维蛋白原的吸附 补体（体外循环中）细胞因子、粘附因子、组织因子的表达情况,实验方法,数据处理方法,图像分析方法模糊血液相容度法,展 望,用分子生物学的技术在分子水平上，研究材料对基因结构、转录和翻译机制的影响，只有从基因分子生物学水平上建立评价生物材料血液相容性的标准，然后在分子和原子水平上通过分子设计新型生物材料，才能使生物材料的研究再次焕发生机，造福人类。,生物材料生物学评价标准细胞毒性试验,在生物学评价方法研究中,最活跃的是细胞毒性试验方法和血液相容性评价方法。细胞毒性试验,具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点,正日益受到人们的广泛重视。,细胞毒性试验方法研究,1948年Rosen Bluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物,Dubecco在1952年首先提出琼脂覆盖法 SabitaSriva等提出分子滤过法 VanLuyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性,细胞毒性试验观测方法研究,以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量,通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性，是定性的毒性检测。传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。,细胞毒性试验观测方法研究,近年来随着细胞毒性试验的进一步发展,越来越多学者倾向于细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响,并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作为材料的生物相容性评价指标，生物材料相容性评价开始从定性评价逐渐向定量测定发展,细胞毒性试验观测方法研究,反映细胞活力或/和细胞增殖的实验室评价方法：MTT 法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)放射性同位素摄入法荧光染色法 流式细胞光度术.,实验细胞研究进展,目前细胞毒性试验中应用最早及使用最广泛的细胞是L-929细胞,该细胞是Earle等1948年从小鼠皮下组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞(HeLa细胞),实验细胞研究进展,由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组,HeLa细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。,实验细胞研究进展,从九十年代起越来越多的学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不同部位或/和组织来源的细胞作为实验细胞,使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实,其结果也更为准确与客观。,实验细胞研究进展,对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物,因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。单核巨噬细胞来源于人体的血液,在人体免疫系统中起着重要的作用,能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应,同时刺激成纤维细胞生长促进伤口的愈合,因此选择单核巨噬细胞作为评价材料细胞毒性的实验细胞,有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响。,由于新材料不断涌现、材料植入体内的部位及使用目的日趋繁杂、材料毒性作用的强弱以及材料与机体反应的复杂性等因素,决定了细胞毒性试验中实验方法及实验细胞的多样性。根据生物材料本身的理化特性、植入体内的部位及使用目的选择适当的实验方法和实验细胞至关重要。通过结合免疫、化学、放射及影像学等多学科的技术发展,使人们进一步深入了解细胞结构和功能的变化关系,进而阐明材料对细胞的作用机制,是今后细胞培养法评价材料生物相容性的发展方向。,新的生物学评价试验方法应包括的内容,新材料对人体免疫防御系统影响及许哦亚机制的研究方法以及材料对各种补体及补体激活产生的裂解产物等评价补体系统激活的试验方法；评价材料对体内的各种细胞因子影响的试验方法；生物材料对细胞生长、凋亡影响的评价试验方法；降解控释材料参与体内代谢过程吸收、分布、排泄的试验方法；智能性材料载体内进行信息传递及功能调控的评价试验方法；药物控释材料的生物相容性评价试验方法；净化功能生物材料的生物相容性评价试验方法；组织工程所需的对培养细胞生长、抑制、扩增、黏附等生物材料的生物形容性评价试验方法。,生物相容性研究及评价展望,研究对机体全身各组织、器官及其生理功能系统产生的影响；植入体内的降解缓释材料及其所载的活性物质降解释放后载体内参与的那些代谢过程，载参与代谢过程中吸收、分布、排泄的途径和颗粒亲和留贮场所；组织工程细胞基质支架和载体材料载细胞生长、扩增进而形成替代组织、器官过程中对细胞基因调控的影响；智能话生物医用材料载体内对产生效应的靶器官或靶器官之间信息传递、功能调控的研究；生物医用材料的不同理化性能、本题结构的变化对体内各种细胞因子的影响，产生正负效应两方面的作用。,