大肠杆菌转化实验.docx

大肠杆菌转化实验大肠杆菌转化实验 大肠杆菌转化可以：将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；验证大肠杆菌感受态细胞效果；用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴，制冰机，恒温摇床，培养皿，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 3材料和试剂： 质粒DNA，重组DNA，培养基，LB培养基，无菌ddH2O，IPTG，X-gal。 4实验准备： 无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，20%IPTG，2% X-gal。 5操作步骤： 事先将恒温水浴的温度调到42。 从-70 超低温冰柜中取出一管感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。 加入10l连接产物，轻轻震荡后放置冰上20min。 轻轻摇匀后插入42水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。 在超净工作台中向上述各管中分别加入900l LB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡30min到50min 在超净工作台中取上述转化混合液100300l，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40l 2% X-gal，8l 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜。 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。