叶绿素含量测定方法.docx

叶绿素含量测定方法实验14 叶绿素a和b含量的测定 一、目的 学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。 二、材料用具及仪器药品 菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶、漏斗、滤纸、乙醇 三、原理 叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式： D665=83.31Ca+18.60Cb.(1) D649=24.54Ca+44.24 Cb.(2) (1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。 为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。 82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。 16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。 解方程式(1)(2)，则得 ： CA=13.7 D6655.76 D649(3) CB=25.8 D6497.6 D665 (4) G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649(5) 此时，G为总叶绿素浓度，CA、CB为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。 四、方法步骤 1称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml。 2取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。 计算结果： 叶绿素a含量=CA´25´1 10000.2叶绿素b含量=CB´叶绿素总量=G´251 ´10000.2251 ´10000.2 五、实验报告 计算所测植物材料的叶绿素含量。 六、思考题 测定叶绿素a、b含量为什么要选用红光的波长？ 3. 2 叶绿体色素的含量测定 原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即： A CL 式中：为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。要测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A66382.04Ca+9.27Cb (1) A64516.75Ca+45.60Cb (2) 式、中的A645和A663为叶绿素溶液在波长663 nm和645 nm时的吸光度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg·L-1为单位。 解方程组(1)、(2)，得： Ca12.72A663-2.59A645 (3) Cb22.88A645-4.67A663 (4) 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT： CT Ca+ Cb 20.29A645+8.05A663 (5) 另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数(均为34.5)，也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)而求出叶绿素a、b总量： CTA652×1000/34.5 (6) 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80丙酮提取液中三种色素含量的计算公式： Ca12.21A663-2.81A646 (7) Cb20.13A646-5.03A663 (8) Cc (1 000A470 -3.27Ca-104Cb)/229 (9) 式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cc为类胡萝卜素的总浓度；A663、A646和A470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的吸光度。 由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm，可据此列出以下关系式： Ca13.95A6656.88A649 (10) Cb24.96A6497.32A665 (11) Cc (1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 (12) 材料、仪器设备及试剂 1. 材料 新鲜植物叶片。 2. 仪器设备 分光光度计；电子天平(感量0.01g)；研钵；棕色容量瓶；小漏斗；滤纸；吸水纸；擦镜纸；滴管。 3. 试剂 95乙醇(或80丙酮)。 石英砂。 碳酸钙粉。 方法 1取新鲜植物叶片(或其他绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎 (去掉中脉)，混匀。 2称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及23ml 95乙醇(或80丙酮)，研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置35min。 3取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。 6. 结果计算 按公式(10)、(11)、(12)(如用80丙酮，则按公式7、8、9)分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的浓度(mg·L-1)。(10)、(11)式相加即得叶绿素总浓度。 求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重或干重的各种色素的含量： A n·C·N·W-1 A叶绿体色素的含量； C色素的浓度； n提取液体积； N稀释倍数； W样品鲜重。 注意事项 1为了避免叶绿素光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。 2叶绿体色素提取液不能混浊。可在710nm或750nm波长下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时吸光度值的5，否则应重新过滤。 3用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2，叶绿素b为19，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。 4在使用低档型号分光光度计(如722型、721型等)测定叶绿素a、b含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低(57nm)，与高中档仪器如岛津UV-120、UV-240等测定结果相比，叶绿素a的测定值偏低，叶绿素b值偏高，ab比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正，具体校正步骤参照有关文献进行。 思考题 1. 叶绿素a、b在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为什么？ 2为什么提取叶绿素时干材料一定要用80%的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？