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医学分子生物学 可缩印 基因结构 1、启动子 在DNA分子上，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列称为启动子。大部分位于转录起始点上游-25bp附近。核心序列为TATA，叫Hogness 盒或TATA盒。 2、增强子(enhancer) 是能够结合特异反式作用因子，促进特定基因表达的DNA序列，决定着每一个基因在细胞内的表达水平。 3、沉默子(silencer) 是抑制基因转录的特定DNA序列，当其结合一些反式作用因子时对基因的转录起阻遏作用，使基因沉默。 4、上游启动子元件(upstream promoter element) 是TATA盒上游的一些具有调控作用的DNA序列。 5.反应元件(response elements) 一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合，调控基因的表达。 6、poly(A)信号 这个序列对于mRNA转录终止和选择性剪接加工过程加poly(A)尾是必不可少的7、非翻译区在结构基因两侧，还有非翻译区。即5-端和3-端非翻译区( UTR)。 8.顺反子：指mRNA分子中编码蛋白质多肽链的数量。 9.结构基因在基因中，编码蛋白质及编码RNA的序列。 10.结构基因中DNA双链中的能指导转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，或有意义链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，或反义链. 11.断裂基因(split gene) 真核生物的结构基因在DNA上是不连续的，由若干个编码序列与非编码序列互相间隔组成，称为断裂基因。 其中，编码序列叫外显子(exon)，非编码序列叫内含子(intron)。 12.组成性剪接 13.选择性拼接 14.mRNA编辑：是指转录后在mRNA水平上改变外显子遗传信息的过程，包括核苷酸的替换、删除及插入等。 15.顺式作用元件 : DNA分子上参与转录调控的序列统称为顺式作用元件。 反式作用因子(trans-acting factor): 能与顺式作用元件相结合的蛋白质叫反式作用因子。 16.操纵子(operon)：原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。 17.Concept of gene expression： 基因经过转录及翻译，产生具有特异生物学功能产物的过程。 18. 基因表达调控： 基因表达是在一定调节机制控制下进行的，生物体随时调整不同基因的表达状态，以适应环境、维持生长和发育的需要。 19.时间特异性(temporal specificity)或阶段特异性(stage specificity)按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生 20.空间特异性(spatial specificity)在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现. 21.细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称* 22.管家基因 (housekeeping gene)： 某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少，这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常称之为管家基因. 23.个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。叫组成性基因表达(constitutive gene expression). 24.协调表达(coordinate expression) ：在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达。 25.基因转录的调节是最重要、最复杂的基因表达调节点，主要涉及以下5个基本要素。 1. Cis-acting elements (顺式作用元件)DNA分子上参与转录调控的序列统称为顺式作用元件。2. Tran-acting factors: 能与顺式作用元件相结合的蛋白质叫反式作用因子。3. RNApol (RNA聚合酶) 4. Interaction trans-acting factors with cis-acting elements (蛋白质-DNA相互作用）5. Interaction proteins with proteins 26.共有序列 实验发现不同结构基因的启动序列中，在-10和-35附近，碱基高度保守，因此，这2个序列叫共有序列或保守序列. 27.操纵序列 是位于启动子与结构基因之间，能与阻遏蛋白(repressor，R)结合，能抑制结构基因转录。 28.模体: 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合 基因操作,核算杂交 29.增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象 30.解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。 31.Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。 32.DNA复性(renaturation) 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性.复性条件：Tm5度 4度以下几乎不复性. 33.退火(annealing),热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为*. 34.探针 (probe) 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针。基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之间在核酸序列上要有高度的特异性 35.cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产生的。 36.设计寡核苷酸探针的原则：1）序列及长度 根据靶分子的序列而定，长度一般为18-50个核苷酸合适。2）碱基成分一般G+C含量为40%-60% 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发夹”结构 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 5）与非靶标区域的同源性不超过70% 37.放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物：1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应2）配体：生物素-亲和素反应3）荧光素 (FITC、罗丹明)4）化学发光探针 37".核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 基因操作 38.核酸分子杂交所用的探针分为化学法和酶法 化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。 酶法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。 39.两种常用的酶法标记：1）缺口平移法 2）随机引物法 40.探针的纯化 ：乙醇沉淀法 SG-50柱层析法 微柱离心法 41.分子杂交：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。 42.印迹杂交 将通过凝胶电泳分离的核酸片段转移到特定的固相支持物上,在转移过程中，核酸片段保持其原来的相对位置不变，然后采用标记的核酸探针与结合于固相支持物上核酸片段进行杂交的技术。 印迹杂交类别： DNA印迹技术 (Southern blotting)? RNA印迹技术 (Northern blotting)？ 蛋白质的印迹分析 (Western blotting？ 43.斑点印迹杂交:将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及表达的定性或定量研究，称为*。 44.原位杂交:核酸保持在细胞或者切片中，经过适当方法处理细胞或组织后，再将标记的探针与细胞或组织中的核酸杂交，称为*。 45.基因测序：是确定DNA双股链上每个独立结构单元或碱基的确切顺序的过程。 47.定位克隆：从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 48.体细胞杂交:细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞(杂种细胞). 49.连锁分析原理:基因在染色体上成直线排列,不同基因相互连锁成连锁群,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或者遗传标记相连锁的特点进行定位。 50.表型克隆：建立在表型的基础上,对特定致病基因DNA片断的直接克隆. 51.转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 52.转基因动物过程：转基因载体的构建 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中 对转基因动物进行鉴定 53.核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 54.基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 55.反义RNA是：根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子。 56.RNA干涉技术是：利用体外合成的短双链RNA，抑制细胞内特定基因表达的技术,是转录后基因失活的一种工具。 基因操作pcr相关 57.PCR反应的步骤： 在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板 DNA，人工合成的两个DNA引物，四种脱氧单核 苷酸，一种耐热的多聚酶和Mg2+。 将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为两条单链； 然后降低反应温度，使两条引物在低温下 分别与两条模板互补退火，形成局部双链； 再升高反应温度至中温，此时多聚酶以dNTP为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链(延伸)。 如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段。 58.Real-time PCR 它是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 59.基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 60.生物芯片(biochip) 指通过微加工技术将生物大分子或细胞有序地固化于固体芯片表面，以实现对核酸、细胞、蛋白质等的准确、快速、大规模的检测的分子生物学实验技术。 生物芯片分为三大类：基因芯片、蛋白芯片、芯片实验室。其中DNA芯片最常见。 61.基因芯片(gene chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。 基因芯片的优点：高通量、大规模快速高效高灵敏度 高度自动化应用广技术操作简单 62.蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析 遗传性疾病 63.遗传性疾病，是指父母的生殖细胞，也就是精子和卵子里携带有病基因，然后传给子女并引起发病，而且这些子女结婚后还会把 病传给下一代。 64.基因变异致病的主要类型:染色体异常,基因结构的突变,基因表达的异常。 65.基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接探测基因结构及其表达水平，从而对疾病作出诊断的方法。 检测目的物分为DNA和RNA两类。 66.基本原理：基因诊断的基本原理是通过检测致病基因的存在、量多少、结构变化与表达水平是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常表化，以此做为疾病诊断的依据。 67.临床意义在于不仅能对有表型出现的疾病做出明确诊断，而且可实现快速早期快速诊断：如产前诊断遗传性疾病，检出感染性疾病潜伏期的病原微生物，还可早期发现某些肿瘤。 确定个体对疾病的异感性，进行疾病的分期分型、疗效监测、预后判断、疾病预报 68.常用技术方法:核酸分子杂交,聚合酶链反应,限制酶切分析 基因测序,基因芯片(chip) 1、已知基因突变的检测 PCR/等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交法 限制性内切酶酶谱分析 2、未知基因突变的检测 PCR/SSCP，测序 基因芯片 69.限制性内切酶酶谱分析法：基因突变可能导致基因上某一限制性内切酶位点的丢失、增加或位置改变，利用限制性内切酶和特异性DNA探针处理，比较待测DNA和野生型DNA酶切片段长度、数量上的差异来判断是否存在基因变异 (常用于点突变)。 70.基因诊断的途径 基因点突变的诊断 DNA多态性分析 基因表达异常的检测 外源异常基因的检测 71.DNA多态性：在人类基因组中，由于 存在各种各样的中性突变，以及存在许多重复序列的不同导致个体间核苷酸序列的差异。 72.限制性片段长度多态性分析由于DNA多态性的存在，导致限制性内切酶位点改变，因此，利用同一限制性内切酶消化基因组DNA时，在同一生物的不同个体中会出现长度和数目不等的DNA片段图谱。也称DNA指纹。RFLP分析分两种类型： RFLP直接分析法-限制性内切酶酶谱分析法 RFLP间接分析法-基因连锁分析 73.扩增的多态性DNA: 由于基因组中存在各种类型的重复序列如小卫星DNA(又称可变数目的串联重复序列，VNTR)，微卫星DNA(短串联重复序列，STR)等，用随机/特异引物进行基因组DNA 的PCR扩增，电泳分离扩增片段，得到扩增的多态性DNA 片段图谱。 74.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 75.单链构象多态性是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或突变的检测。 基因治疗 76.基因治疗：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 76.策略：基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、免疫基因疗法、活化前体药物基因疗法 、化疗保护性基因疗法。 77.特异性细胞杀伤： 利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因表达载体，通过配体-受体的结合，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以靶向性杀伤该肿瘤细胞。 78.DNA指纹：用限制性内切酶消化基因组DNA，并用特异性核酸探针杂交，取得不同大小的DNA 片段的区带图谱，该图谱具有高度的个体特异性，类似于人的指纹。 79.等位基因特异性寡核苷酸(ASO)：为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。 80.基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 81.目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物 82.基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 83.克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 84.载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 85.质粒 (plasmid) 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 86.转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 真核生物 87. 1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组2、基因组DNA为线性结构，有多个复制起点(ori)，可从染色体的多个位点起始复制。3、真核生物基因组的结构基因大都为断裂基因，有内含子结构。4、基因组中存在大量的顺式作用元件(cis-acting element) 5、真核生物基因组中的结构基因转录产物通常为单顺反子。6、真核生物基因组中编码序列(coding sequence)约为基因组的25%，非编码序列(non-coding sequence，NCS)90以上。7、真核生物基因组中含有大量重复序列，重复次数可高达百万倍。 这些重复序列大多属于NCS。8、真核生物基因组存在多基因家族, 9、真核基因组中存在大量的DNA多态性. 10、真核基因组具有端粒结构 88. 反向重复序列 (inverted repeats , IR ) 由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成的序列，叫反向重复序列。根据重复序列的对称方式，可分为二元旋转对称重复序列与镜像对称重复序列； 根据是否有间隔，又分为有间隔重复序列与无间隔 (回文结构 ) 89. 卫星DNA为另一类高度重复序列。重复单位一般由2-10bp组成，成串排列，故又称串联重复序列(tandem repeats)或正向重复序列。 90. 单拷贝序列在一个基因组中只出现一次或很少几次的碱基序列称为单一序列。是结构基因的主要组成部分 特点：单一序列的两侧常被重复序列隔开，以间隔序列和散在分布的重复序列构成侧翼。 91. 假基因(pseudogene)。在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因，用表示. 1）假基因无内含子 2）两侧有顺向重复序列 92. 端粒(telomere)是真核生物染色体线性基因组DNA末端的一种膨大结构，由一段单链DNA序列和蛋白质构成。 93. 端粒的功能：在端粒酶(telomerase)的作用下： 1) 维持染色体的稳定性； 2) 维持DNA复制的完整性，减缓细胞衰老速度。端粒酶是目前分子生物学研究的热点之一。 94. mtDNA的结构特点：1）mtDNA为母系遗传； mtDNA的复制与核DNA的复制相对独立； 结构基因不含内含子，前导序列、带帽序列和终止信号，部分区域有基因重叠，因此病理性mtDNA突变更易发生； mtDNA突变频率更高. 原核生物 95. 原核生物DNA原核1. 基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成，并形成类核2. 染色体DNA通常与细胞膜相连3、结构基因的编码是连续的，无内含子，转录后不需要剪切； 4、功能相关的几个结构基因往往串联排列在一起组成操纵子结构，受上游共同的调控区控制。5、编码序列一般不重叠；基因组中任何一段DNA不会用于编码2种蛋白质。 6、基因组中的重复序列很少。 7、编码蛋白质的结构基因多为单拷贝基因;但编码rRNA的基因往往是多拷贝的，这有利于核糖体的快速组装。8、结构基因在基因组中所占的比例 50 9、基因组中只有1个复制起点； 10、有多种功能的识别区域。 96. 质粒:是存在于细菌染色体外的，具有自主复制能力的共价环状双链DNA分子。 97. 质粒的基本特性1、存在于原核生物细胞中的闭合环状双链DNA，是一种核外遗传物质，但不是细胞生存所必需；2、有独立的复制系统，可独立于核DNA进行复制。 3、质粒DNA含有少量编码蛋白的基因，可赋予细菌特定的遗传性状，有利于细菌的生存。4、具有在宿主细胞之间进行转移的能力 98. 质粒与宿主细胞的关系 1）质粒对宿主的生存不是必需的。2）质粒离开宿主就无法生存。质粒赋于宿主各种有利生存的表型，使宿主获得生存优势。在某些情况下，质粒可控制宿主细胞的分裂 99. 质粒的遗传控制1、复制控制：控制质粒的拷贝数 2、分配区控制：使质粒在细菌分裂过程中精确分配到子细胞 3、细胞分裂控制。 4、质粒的不相容性：具有相同的复制起始点和分配区的质粒不能共存于一个宿主菌 99. 细菌基因组学研究及意义了解病原微生物的致病机制 可加快重要致病基因的发现速度寻找病原菌特异的DNA序列，提高临床诊断的效率和准确性。 为筛选有效药物及发展疫苗提供参考 100. 病毒基因组的结构特点、不同病毒基因组大小相差较大2、病毒基因组可以由DNA组成，也可以是RNA组成，但每一种病毒基因组只有一种核酸组成。3、病毒的基因组有连续的也有节段性的 4、病毒的基因组编码序列大于90% 5、除反转录病毒基因组有两个拷贝外，其它病毒基因组都是单倍体，即每个基因在病毒颗粒中只出现一次。6、相关基因丛集7、基因重迭8、结构基因有连续的，也有不连续的