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医学分子生物学复习思考题及答案医学分子生物学复习思考题及答案 第十三章 真核基因及基因组 1、什么是基因组？ 答：基因组是指一个生物体内所有遗传信息的总和。人类基因组包含了细胞核染色体DNA及线粒体DNA所携带的所有遗传信息。不同生物的基因及基因组的大小及复杂程度各不相同，所贮存的信息的量和质存在着巨大的差异。 2、真核基因的基本结构包括哪些？试述之。 答：真核基因的基本结构包括编码序列及非编码序列 编码序列：包括编码蛋白质及功能RNA的核苷酸序列。真核基因的编码序列由外显子及内含子组成，外显子及内含子相间排列，称断裂基因。内含子数目较外显子数少一个，组蛋白编码基因例外，不含有内含子。外显子决定表达蛋白多肽及RNA的一级结构。 因此，外显子序列结构通常比较保守，一个碱基的突变常致基因功能的改变，而内含子序列相对变异较大。每个内含子5末端与外显子相接处，常为GT，3末端与外显子相接处常为AG，这一共有序列是mRNA剪接加工时的剪接识别信号。 非编码序列：包括编码序列两侧的对基因表达具有调控作用的一些调控序列：如启动子、增强子等 外显子；在基因序列中，出现在成熟mRNA分子上的序列。 内含子：外显子之间、与mRNA剪接过程中被删除部分相对应的间隔序列。 3、什么事顺式作用元件？其化学本质是什么？顺式作用元件主要有哪些？ 答：非编码序列对基因表达起调控作用，又称调控序列。位于结构基因的上游及下游，称它们为顺式作用元件，包括启动子、增强子、沉默子、上游调控元件、加尾信号等。 4、真核基因启动子的功用是什么？其位置如何？ 答：DNA分子上能介导RNApol与DNA结合并形成转录起始复合物的序列，称之为启动子。大多数真核基因启动子都位于结构基因上游，启动子本身不被转录。但也有一些真核基因启动子的DNA序列位于转录起始点的下游，它们可以被转录，如编码tRNA基因的启动子。 5、试述真核基因的三类启动子？ 答：类启动子：具有类启动子的基因主要编码rRNA，它能被 RNApol识别结合，转录产物是rRNA，类启动子结构特征是富含GC。 类启动子：具有类启动子基因主要编码mRNA及一些小分子RNA。它能被 RNApol 识别结合，转录产物是mRNA及小分子RNA。类启动子结构特征是具有TATA盒。有的类启动子在TATA盒的上游还存在CAAT盒及GC盒 类启动子：含有类启动子的基因主要编码tRNA。此外，也编码5SrRNA，它能被 RNApol识别结合，转录产物主要是tRNA。其结构特征是含有A盒、B盒及C盒。 A盒：TGGCNNAGTGG B盒：GGTTCGNAACC 6、试述增强子的特点？ 答：效率：增强子是增强真核基因启动子工作效率的顺式作用元件，是真核基因表达中最重要的调控序列，它决定着基因的表达水平。 位置：增强子既可在启动子的上游，也可在启动子的下游，有的增强子还可位于内含子中,因此，增强子的作用不受序列方向的影响。 距离：增强子与所调控基因之间的距离可近可远，近的几十个碱基，远的可达数千个碱基。因此，它能进行远距离调控。 无基因特异性：一种增强子能对任何真核基因发挥作用，甚至病毒增强子在真核基因中同样能发挥作用。如病毒SV40的增强子插入到真核-珠蛋白基因附近时，能使其转录效率增强200倍。 7、什么是沉默子？ 答：沉默子是能抑制基因转录的特定DNA序列，当其与相应的反式作用因子结合时，对基因转录起阻遏作用，使基因沉默。沉默子是负调控。 8、真核基因组的结构特点有哪些？ 答：、真核基因组中编码序列所占比例远小于非编码序列：人基因组中编码序列仅占全基因组的1%，一个基因的全部序列中，编码序列只占5%。 、高等真核基因组含有大量重复序列：可占到全基因组的80%以上，人基因组中重复序列可达50%以上。 、真核基因组中存在着多基因家族及假基因：人染色体基因组编码约2万2.5万个基因，其中存在着1.5万个基因家族。基因家族中有假基因。 、人基因组中大约60%能进行可变剪接，其中的80%的可变剪接会使蛋白质的氨基酸序列发生改变，产生功能相关的不同蛋白质。 、真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体储存于细胞核内。 9、什么是高度重复序列？按结构特点不同主要分为哪两种?试述之？ 答：重复频率可达106 以上，人基因组中约占20%，高度重复序列按结构特点不同主要分为二种：反向重复序列及卫星DNA 1、反向重复序列 反向序列：两段具有相同碱基顺序，彼此间存在碱基互补，在同一条DNA链上反向排列。也称回文结构。这两段反向互补序列组成一个重复单位，其长度约300bp。这种重复单位多数是散在分布于基因组中，其总长度约占人基因组的 5% 。 2、卫星DNA 重复单位长度一般为210bp，呈串联状排列,也称短串联重复序列在人基因组中约占 5%6% 。 高度重复序列的功用： 参与复制水平的调节 参与基因表达调控 参与染色体配对的调控 10、什么是中度重复序列？根据重复片段长度不同又分为哪两种类？试述之。什么是Alu家族？什么是Kpnl家族？ 答：重复频率在数十次至数万次，重复片段大多数呈散在分布，与单拷贝基因间隔排列，少数呈串联状排列在某一区域。约占总基因组的1%30%。 根据重复片段长短又可分为两种类型。 1， 短分散重复片段：重复频率可达数万次，重复片段平均长度约300500bp，与平均长度为1000bp的单拷贝序列间隔排列。如Alu家族等。 2，长分散重复片段：重复片段平均长度约3500bp5000bp，与平均长度为13Kbp的单拷贝序列间隔排列。 1，Alu家族：重复频率可达3050万次，Alu家族成员长度约300bp，与6kbp序列间隔排列。约占人基因组的3%6%。由于300bp片段中，有限制性内切酶Alu的酶切 位点 AG CT，酶切后得到130bp及170bp。故称Alu家族。Alu家族是人基因组中含量最丰富的一种短分散中度重复序列。 2，kpn家族：仅次于Alu家族，重复频率约30004800，重复片段长度约6.4Kbp，其中，含有限制性内切酶 kpn的三个酶切位点，酶切后得到1.2Kbp, 1.5Kbp, 1.8Kbp和 1.9Kbp 四个片段，故名 kpn家族. 11、什么是单拷贝序列？ 答：单拷贝序列在单倍体基因组中只出现一次或几次，大多数蛋白质的编码基因属于这一类,在基因组中单拷贝序列的两侧常常是散在分布的重复序列。单拷贝序列改变常常导致表达蛋白质的结构与功能异常，临床多种疾病的发生都与这种改变有关。 12、什么是多基因家族？什么是假基因？ 答、多基因家族：多基因家族是真核基因组结构的另一特征，它是指某一祖先基因经过重复和变异所产生一组结构相似、功能相关的基因。 多基因家族中，不能表达蛋白质或功能RNA的那个基因，称之为假基因。假基因往往缺少内含子。假基因的产生可能是由原来有功能的基因发生缺失、倒位或点突变，在转录得mRNA后，经剪接修饰得mRNA，再经逆转录得到cDNA，然后整合到染色体DNA中所致。 13、线粒体DNA共编码几个基因？分别编码哪些物质？ 答：mtDNA 独立编码线粒体中的一些蛋白质，mtDNA全长16569bp，共编码37个基因，其中13个编码 mRNA(mt-mRNA)。翻译出与呼吸链相关的一些酶及蛋白质。22个编码mt-tRNA，2个编码mt-rRNA。 第十八章 基因表达调控 1、什么是基因表达？ 答、基因表达就是基因转录得相应的RNA，再翻译成多肽链并加工成具有特殊生物学活性的蛋白质。有的基因转录得功能RNA不产生蛋白质这一过程，也属于基因表达。基因表达就是基因携带的遗传信息表现为表型的过程。 2、基因表达的基本特点有哪些？ 答：基因表达具有时间特异性及空间特异性 基因表达方式的多样性 基因表达受顺式作用元件及反式作用因子的共同调节 基因表达调控呈现多层次和复杂性 基因表达调控是生物体生长和发育的基础 3、什么是基因表达的时间特异性、空间特异性？ 答：1. 基因表达具有时间特异性(Temporal specificity):某一特定基因的表达，是严格按照一定的时间顺序发生的。从一个受精卵发育成一个成熟的个体，在各个发育的不同阶段，各个基因都严格按照特定的时间顺序开放表达或封闭，生物体表现为分化、发育的相应时间性。因此，基因表达的时间特异性又称阶段特异性。又如甲胎蛋白，胎儿时，肝细胞活跃表达，成人后表达极低。患肝癌时这一基因又被激活表达。 2. 基因表达的空间特异性:同一机体的不同组织细胞中都含有相同的各种基因，但同一种基因在不同的组织细胞表达情况不一样。如编码胰岛素的基因只在胰岛细胞 中表达，与思维相关的一些基因只在脑细胞中表达，与物质代谢相关的一些基因主要在肝细胞中表达等。因此，基因表达的空间特异性，也称基因表达的组织特异性或细胞特异性。不同组织细胞表达的差异，称差异性基因表达。机体内决定不同类型的细胞，不是基因本身，而是基因表达的模式不一样。 4、什么是管家基因？什么是基本基因表达？ 答：管家基因：这类基因在一个生物体的所有细胞中都持续表达，变化较小，不易受内外环境的影响，其表达产物对生物体的全部生命过程都是必需的，必不可少的，称这类基因为管家基因。 (2) 基本基因表达：管家基因的表达称基本基因表达，它只受启动子及启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他调节机制的影响。如TAC中一些酶的编码基因及其表达。 5、什么是诱导表达？阻遏诱导？ 答：(1) 诱导表达：某些基因，在特定的环境信号刺激下被激活，基因表达产物增加，这类基因称可诱导基因。可诱导基因的表达过程称为诱导表达。如DNA损时，DNA修复酶基因被诱导激活。 (2) 阻遏表达：某些基因，在特定的环境信号刺激下，其活性被抑制，基因表达产物减少，这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因的表达过程称为阻遏表达。如在细菌培养基中加入色氨酸时，细菌体内与色氨酸合成有关的酶的编码基因就会被抑制。 6、什么是反式作用因子？基因表达调控的分子基础是什么？ 答：反式作用因子:是一些蛋白质因子，它对结构基因的表达起调控作用。编码反式作用因子的基因位于远离结构基因的同一条DNA链上，也可在另一条DNA链上。 蛋白质-DNA以及蛋白质-蛋白质的相互作用是基因表达调控的分子基础。 7、基因表达调控呈现在哪些层次？其中，最重要的调控位点是什么？ 答、基因表达体现在基因、转录及翻译，在这些层次上均存在基因表达调控的机制，因此，调控表现为多层次和复杂性。 1. 基因调控 (1) 基因拷贝数多，表达产物量也多。某种特定细胞能选择性的扩增某个基因，于是，该基因相应的蛋白质呈现高表达。 (2) 基因DNA甲基化,DNA重排等均可在基因信息水平上影响基因表达，以适应机能需要。 2. 转录调控 (1) 转录过程多环节的调节 (2) 真核生物转录得的mRNA要进行加工修饰，如mRNA的选择性剪接， mRNA编辑等，是基因表达调控的重要位点。 (3) 成熟 mRNA从细胞核进入细胞液的调控。 (4) 非编码RNA在转录水平上对基因表达调控。 3. 翻译调控 (1) 蛋白质合成过程的调控：翻译的起始，肽链合成延长是常见的调控位点。 (2) 翻译后加工修饰的调节：调节改变蛋白质结构，从而调节蛋白质的功能。 上述多层次复杂调控中，转录水平，尤其是转录起始水平的调节是基因表达最重要的调控点。 8、原核基因的结构特点有哪些？ 答：1. 基因组中很少有重复序列。 2. 结构基因连续排列，多为单拷贝基因，但编码 rRNA的基因仍然是多拷贝基因。 3. 结构基因在基因组中所占比列较大，约50%，远远大于真核基因组。 4. 原核基因组中的结构基因，多数是以操纵子为单位排列。操纵子是原核基因转录调控的基本单位 5. 原核基因可边转录边翻译。能在同一空间内完成，时间上差异不大。 9、原核基因转录调控的基本单位是什么？操纵子结构有哪些？分别简述之。 答：操纵子是原核基因转录调控的基本单位 操纵子结构包括：结构基因和调控序列 1. 结构基因：由几种功能相关蛋白质的结构基因串联排列而成，常称之为编码区。这些结构基因共同使用一个启动子及一个转录终止信号。 2. 调控序列：包括启动子、操纵元件及调节基因 10、调节基因表达哪些蛋白质？这些蛋白质各有何作用？ 答：调节基因：位于结构基因上游稍远处，它编码三类蛋白质：特异因子、阻遏蛋白、激活蛋白 特异因子：它决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的识别能力。 阻遏蛋白：能特异识别结合操纵元件，抑制转录过程 激活蛋白：能与启动子上游邻近的DNA序列结合，从而提高RNA聚合酶与启动子的结合能力。增强转录活性。这种效应称之为正性调控。如分解代谢物基因激活蛋白就是典型的激活蛋白 11、乳糖操纵子结构包括哪些？分别试述之。 答：乳糖操纵子包括结构基因及调控序列 1. 结构基因：乳糖操纵子结构基因含有编码与乳糖代谢有关的三种酶的结构基因，即：Z基因、Y基因及A基因。 Z基因：编码的酶是-半乳糖苷酶 Y基因：编码的酶是通透酶 A基因：编码的酶是乙酰基转移酶 2. 调控序列：包括 (1) 启动子 (2) 操纵序列 (3) 调节基因：I 基因表达产物阻遏蛋白与O序列结合，于是，RNA聚合酶不能滑向结构基因，操纵子不能转录而处于关闭状态。 (4) CAP结合位点：位于启动子上游，CAP结合该部位后，能增强转录过程。 12、细胞周围环境中有乳糖时及无乳糖时，乳糖操纵子表达是如何调节的？ 答：1. 细胞周围环境中不存在乳糖时：I 基因表达产物阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与启动子结合及滑动，于是，转录终止，与乳糖代谢有关的三种酶基因不表达。 2. 周围环境有乳糖时：乳糖代谢产物半乳糖，能与阻遏蛋白结合，于是阻遏蛋白分子构象改变，随之与O序列分离，结果，RNA聚合酶能与P序列结合，并滑向结构基因，转录开放，表达出与乳糖代谢有关的三种酶，对乳糖进行利用代谢。 13、真核基因有哪些特点？ 答：真核基因组远大于原核基因组 真核哺乳类基因组中，编码蛋白质及功能RNA的序列只占总基因组的10%，其余90%基因结构序列中，包含有大量重复序列，功能至今还不十分清楚。 真核生物编码蛋白质的基因是不连续的，由一些内含子间隔，故称为断裂基因 真核生物一个结构基因只转录生成一条mRNA，它包含一种蛋白质的编码信息。即使蛋白质四级结构中的不同亚基，都是由不同的基因表达。 真核基因在细胞核内与多种蛋白质结合构成染色质，染色质的结构状况也直接影响着基因表达。 真核生物基因信息不仅存在核DNA上，还存在线粒体DNA上。 14、染色质如何参与基因表达调控？ 答：染色质结构致密，不易转录，染色质结构松弛，容易转录。在缺乏核小体结构的“裸露”DNA链，特别容易转录，称之为转录超敏位点 组蛋白修饰调节 1. 乙酰化修饰：组蛋白乙酰化修饰，使染色质由紧密变得松弛，有利于转录。 2. 甲基化修饰：组蛋白甲基化，使组蛋白与DNA亲和力增加，染色质变得紧密，不易转录。反之，去甲基化，则有利于转录 3. 磷酸化修饰：组蛋白磷酸化修饰能激活基因转录过程。 15、什么是反式作用蛋白调控？ 答：反式作用蛋白特异地结合在相应的顺式作用元件，通过DNA-蛋白质相互作用调节基因表达的强弱，称反式调节作用，包括反式激活作用及反式抑制作用。编码反式作用蛋白的基因位于远离被调控基因的同一条DNA链上或位于另一条DNA链上。反式作用蛋白调控是真核基因表达调控最基本最主要的方式。 16、什么是顺式作用蛋白调控？ 答：基因表达的某些蛋白产物，能特异识别结合这个基因自身的顺式作用元件，从而调节该基因的表达，称之为顺式调节作用。这个具调节作用的蛋白质称为顺式作用蛋白 17、什么是通用转录因子？什么是特异转录因子？ 答：通用转录因子:这类蛋白质因子帮助RNApol与启动子结合，并起始转录过程，它们的作用对所有基因的转录都是必需的。它们的存在没有组织特异性，因此，对基因表达的时间特异性及空间特异性并不重要。如TF D、TF H等。 特异转录因子：这类转录因子是个别基因转录所必需的，它决定该基因表达的时间特异性及空间特异性。这类转录因子有的起转录激活作用，有的起转录抑制作用，分别称为转录激活因子及转录抑制因子。转录激活因子常常是一些增强子结合蛋白。转录抑制因子多数是沉默子结合蛋白。 18、转录因子的DNA结合结构域有哪些？简述之。 答：(1) 锌指模体结构(p372)：是一种蛋白质空间结构，外形似手指。它含有23个AA残基，形成一个-螺旋及两个反向平行折叠。 -螺旋上有二个组氨酸残基。每个-折叠上各有一个半胱氨酸残基。这四个氨基酸残基这四个AA残基通过配位键与锌离子相连，就形成了外形似指 的结构。它插入DNA双螺旋大沟，从而实现转录因子与DNA的结合 (2) 碱性螺旋-环-螺旋模体结构：它至少含有二个-螺旋及一小段短肽形成的环所组成，其中一个-螺旋富含碱性氨基酸而显碱性，容易与带负电的DNA结合。 (3) 碱性亮氨酸拉链模体结构：在其肽链C-末端的AA序列中，每隔六个AA残基出现一个亮氨酸残基，这段肽形成-螺旋时，亮氨酸有规律的出现在-螺旋的一侧。二个这种结构通过亮氨酸之间的疏水作用结合成的二聚体，外形如同拉链。这个二聚体的N-末端富含碱性氨基酸，而显正电，容易与带负电的DNA结合。 19、mRNA稳定性受哪些因素的影响？ 答：1. mRNA 5端帽结构对mRNA稳定性的影响 mRNA 5端帽结构能增加mRNA稳定性，促进转录，其原因是： (1) 帽结构可对抗细胞内 5-核酸外切酶 对mRNA 的降解作用 (2) 帽结构与帽结合蛋白结合，提高翻译效率 (3)帽结构促进mRNA从细胞核进入细胞质，便于起模板作用 2. mRNA 3端 polyA尾对mRNA 稳定性的影响： 尾结构增加mRNA 稳定性，促进转录，其原因是： (1) polyA尾结构能防止3-核酸外切酶对mRNA的降解 (2) polyA尾结构参与翻译的起始过程 (3) 促进mRNA从细胞核转入细胞质 (4) mRNA 3 端常形成发夹式结构，能防止核酸酶攻击 (5) mRNA 3端若是富含AU序列能与 RNA 特异序列结合，从而参与调节翻译过程。如铁反应元件结合蛋白与mRNA结合后，能促进ALA合成酶的合成等。 23、miRNA对基因表达有何影响？miRNA的特点有哪些？ 答：miRNA属于小分子非编码 RNA，长度约20个碱基，它与一些蛋白质共同组成 RNA诱导沉默复合体 RISC,它能与mRNA结合，从而抑制 mRNA的翻译功能。 miRNA的特点： (1) 长度为20-25个碱基。 (2) 在不同生物中普遍存在，昆虫、家鼠、人类乃至植物中均含有。 (3) 同一种类生物体内，其序列结构具有一定的保守性，但动植物之间其序列结构不存在一致性。 (4) miRNA 的表达具有明显时间特异性及空间特异性。 (5) miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇形式存在于非编码区，它具有高度多样性。 24、siRNA 对基因表达有何影响？什么是RNAi？ 答：siRNA：干扰小RNA是由细胞内的一类双链RNA，在特定条件下，由相应酶的酶切作用，产生了特殊序列的小片段dsRNA，长度约21-23碱基，称之为siRNA。这种双链 siRNA参与组成RISC，并能与特异的靶 mRNA互扑结合，导致mRNA降解，阻断翻译过程。这种由 siRNA介导的抑制基因表达的作用，称之为RNA干扰， 它被广泛用于基因功能研究及基因治疗。 第二十章 常用分子生物学技术的原理及应用 1、什么是核酸分子杂交？ 答：核酸分子杂交：根据核酸单链片段之间碱基互补而相结合的原理，用一已知碱基顺序的DNA或RNA单链片段作为探针来检测未知待测DNA或RNA中的核苷酸顺序。若对探针进行标记，根据有无标记信号而确定有无杂交体存在。又根据探针的碱基顺序，按碱基配对规则就可以测定待测DNA或RNA的碱基顺序。 2、什么是核酸探针？核酸探针的来源有哪些？探针的标记方法有哪些？ 答：核酸探针:核酸探针是一已知碱基顺序的DNA或 RNA单链片段，它能与待测 DNA或RNA 按碱基配对规则进行杂交反应。为了便于观察是否发生杂交反应以及杂交反应的位置及强弱，必须对探针进行标记，从而确定待测核酸是否存在，进而确定待测核酸的碱基顺序。 (2) 核酸探针的来源 人工合成：用核酸合成仪按预定目标合成一已知碱基顺序的寡核苷酸片段，常用的是DNA片段。 从基因组获得：用 PCR法扩增基因组中的某个基因片段。 cDNA探针：从真核细胞液中提取mRNA，经逆转录得到CDNA, 用cDNA全长或其部分片段作为探针。 RNA探针：由于RNA不太稳定，常较少用。 (3) 探针标记 放射性核素标记：用放射性同位素标记探针，检测标记信号，采用放射性自显影法。 荧光染料标记：用荧光染料物质标记探针，检测标记信号：能直接看到荧光 或采用特殊仪器收集荧光信号信息。 生物素标记探针：用生物素标记探针。检测标记信号：生物素分子上连接有特定的酶，加入相应底物后，通过特定酶催化反应过程，产生具有一定有色的物质。 3、什么是Southern印迹？有何应用？简述Southern blotting 的基本过程原理？ 答：DNA印迹也称southern blotting,是 E.Southern 最先发明使用于检测DNA，顾称之。 其具体过程原理是： (1) 将待测DNA用限制性核酸内切酶酶切水解得到大小不同的DNA片段。 (2) 将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳，大小不同DNA片段停留在凝胶板上的不同位置形成不同的区带。 (3) 将含不同DNA片段的凝胶板放到DNA变性溶液中进行变性处理，使双DNA成为单链DNA (4) 将凝胶板上的变性DNA转移到硝酸纤维膜上：用多量吸水纸吸附的毛细管作用，使凝胶板上DNA转移至NC膜上，由于NC膜具有很强的吸附DNA的作用，一旦胶板上DNA转移到NC膜上时，就能牢固的吸附在膜上，并保持原来位置不发生变化。 (5) 将转移后的NC膜经80真空加热或紫外交联仪处理，DNA就能非常牢固的固定在NC膜上，便于进行杂交。 (6) 杂交反应：将标记的探针与NC膜进行杂交，68杂交12小时。 (7)杂交信息监测：放射自显影或荧光信号监测确定有无杂交体、杂交体的位置及强弱。 应用：根据探针的碱基顺序确定目的基因的碱基顺序，对相关基因进行定性分析，还能进行定量析，以及对重组质粒进行分析等。 4、什么是Northern印迹？有何应用？Northern印迹与Southern印迹有何异同？ 答：RNA印迹也称Northern Blotting，其基本过程及原理与Southern blotting 相同，只是监测对象由 DNA换成 RNA。由于被检测RNA分子较小，常无需限制性内切酶来酶切。电泳RNA转移至NC膜上以及杂交信息的检测，都与Southern blotting 相同。由于RNA极不稳定，易受RNA酶降解，因此实验过程中要加入RNA酶 抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯，diethlpyrocarbonate) 应用:主要用于RNA定量分析 (1) 检测组织细胞中某一已知的特异 mRNA的表达水平 (2) 比较不同组织细胞中同一基因的表达情况 5、什么是Western印迹？有何应用？Western印迹的基本过程原理是什么？ 答：蛋白质印迹常称为Western blotting。由于检测蛋白质不是用探针，而是用该蛋白质特异的相应抗体。因此，也称免疫印迹。 1. 实验原理： 将混合组分蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将各组分逐一分开停留在凝胶的不同区带 通过转移电泳方法将凝胶板上的各组分蛋白质转移至NC膜上。 用被检蛋白质相应的特异性抗体与NC膜上的各组分蛋白质进行免疫反应。于是，特异性抗体就与NC膜上相应的特异性蛋白质结合成抗原抗体复合物。 用与第一抗体相对应的特异性第二抗体，将它进行碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记。将这种标记的第二抗体与第一抗体抗原复合物反应。于是标记了的第二抗体就与第一抗体进行特异性的结合。形成了三种物质的三元复合物。 印迹信号的检测： 显色检测：加入相应的底物，在碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的作用下，使底物反应产生具有一定颜色的物质。 放射性自显影检测：用于放射性核素标记信号的检测。 2.应用： 蛋白质特别是微量蛋白质的定性检测：一复合物组分蛋白质中含有微量的目的蛋白质时，可用Western blotting 进行定性检测。 特异蛋白质的半定量分析：特异蛋白质经蛋白质印迹质显色后，与标准量蛋白质比较，经扫描方法可进行半定量测定。 6、什么是斑点印迹？什么是细胞原位杂交？ 答：斑点印迹:将待测DNA或RNA，不需经电泳分离直接点样在NC膜使之呈点状。再用标记的已知碱基顺序的探针与之杂交。如出现阳性杂交体，根据探针的碱基顺序，按碱基配对规则就可确定待测DNA或RNA的存在以及它们的含量。 细胞原位杂交：用组织切片或细胞涂片或细胞印片，对其进行一定处理，使细胞膜通透性增加，用标记的探针与之杂交，在细胞DNA原位置处形成杂交体。常用于肿瘤的基因诊断。 7、什么是PCR？基本原理是什么？ 答：PCR (polymerase chain reaction) 称聚合酶链反应，是由美国生化学 Mullis 于XX年创建的方法。使一个基因片段在试管内经 2-3小时反应后，其拷贝数可增加至百万倍以上，不需要经复杂的分子克隆技术就可得到基因片段的大量拷贝，使得过去很多不能进行的分子生物学实验得以顺利进行。 PCR的基本原理 利用DNA半保留复制的原理结合体外DNA在不同温度下变性、复性的原理建立了高温变性、低温复性、适温下合成链延伸的三步连续反 应的不断循环： 1，高温变性：94左右时，双链DNA中两条单链之间氢键断裂，解开成两条单链，便于起模板作用，但又不影响3，5-磷酸二酯键的稳定性。此温度时，单链DNA引物自身间的聚合也完全解开，引物便于充分发挥作用。 2. 低温复性，便于DNA单链引物与单链模板DNA之间的结合：在55左右时，一对小DNA单链引物中，一条引物与一条模板链3端互补结合。另一条引物与另一条模板链两条3端互补结合。 3. 适温下DNA链合成延伸：在72左右时，在耐热DNApol催化下，以四种dNTP为原料，从引物3-OH上开始延长合成DNA 上述三步连续反应组成一轮循环，上一轮循环的产物又可作为下一轮循环的模板。三步连续反应不断循环，经过 25-30 轮循环后，扩增基因片段的拷贝数可达到百万倍以上。扩增的DNA片段长度基本是两条引物 5端之间的 DAN片段。 8、PCR引物应具备哪些条件？ 答：1、PCR引物为一对DNA单链：其中一条引物与模板双链DNA中的一条模板单链的3端相应部位碱基互补。另一条引物与另一条模板单链的3端互补结合。 2、引物长度：约15-20个核苷酸。 3、引物与模板DNA非扩增区不应该存在碱基互补，否则，将产生一些非特异性的扩增产物。 4、引物的 3端碱基，一定要与模板互补，否则将不产生延伸效应。 5、引物的 5端碱基与模板的互补要求不十分严格，甚至可游离十几个碱基而不影响 PCR 扩增反应。 6、PCR扩增片段长度：复性时两条引物 5端之间的DNA片段。 9、PCR的主要用途有哪些？试述之。 答：获得目的基因，用于目的基因的克隆 根据目的基因两端的碱基顺序，设计合成一对引物从基因组DNA 或 cDNA中进行 PCR扩增，获得目的基因片段。 体外基因定点突变 根据对突变的要求设计合成相应的突变引物，然后进行分段PCR扩增，最后将分段扩增产物再融合扩增。于是定点突变就嵌入到基因组中。 对微量DNA及RNA进行分析 在PCR未出现之前，由于微量DNA信号太弱，不易进行分析 。PCR具有高度敏碱性，微量DNA经PCR扩增后可得到基因的大量拷贝，便于进行定性及定量分析。这在基因诊断、法医中犯罪对象认定及亲子鉴定等方面，都有广泛的应用前景。 DNA序列测定 从基因组DNA经PCR扩增得相应的目的DNA片段后，通过DNA自动测序仪或手工操作法进行DNA直接测序。也可用核酸杂交等方法进行间接测序。 基因点突变分析 1，引物特异性PCR 2，PCR-SSCP 3，等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO) 4，基因芯片技术 10、什么是引物特异性PCR？什么是PCRASO？ 答：、引物特异性PCR：从基因组DNA经PCR扩增得到目的基因，针对目的基因突变点的碱基性质设计合成 3 端与之互补的引物，又进行PCR扩增，于是，突变阳性的基因有扩增产物，突变阴性的基因，没有扩增产物，称之为引物特异性PCR。等位基因特异性寡核苷酸探针分析(PCR-ASO)： 、PCR 扩增突变基因，合成针对突变点的探针，将它与扩增产物杂交，杂交阳性说明有相应的基因突变存在。 11、什么是RTPCR？什么是原位PCR？ 答：RTPCR RTPCR是将 RNA 逆转录反应与 PCR反应联合应用的一种技术。首先，以RNA为模板，经逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，经 PCR 扩增目的基因。目前，RTPCR是真核细胞mRNA进行定性及半定量分析的有效方法。 原位PCR 原位PCR是在组织切片或细胞涂片的细胞内进行PCR。对扩增产物用特异性探针与之进行原位核酸杂交，从而检测出待测DNA或RNA的存在以及存在的部位。虽然这种方法的灵敏度不高，但它是目的基因定位的一个最佳方法。 12、非探针类实时荧光定量PCR的基本原理是什么？ 答：原理：在常规PCR时，加入特殊的荧光染料SYBR Green，这种染料能与双链DNA的小沟区域结合。当这种染料未与DNA结合处于游离状态时，荧光信号强度极低。一旦它与双链DNA通过小沟区域结合后，荧光信号大大增强，约为游离时的1000倍。PCR扩增产物双链DNA越多，荧光信号就越强，下一轮循环变性时，双链DNA能形成单链，荧光近消失，待这一轮循环结束，产生双链DNA时，又出现大量荧光。这样，实时记录了荧光量即DNA量。 13、探针类实时荧光定量PCR有哪三种？试述TaqMan探针法的基本原理。 答：根据使用探针不同又分为：TagMan探针法，分子信标探针法及荧光共振能量转移探针法。 TaqMan探针法基本原理： 在常规PCR反应体系中，加入一条能与模板DNA特异结合的TagMan探针，这个探针的5端标记有荧光报告基团R，3端标记有荧光淬灭基团Q。 当探针上报告基团R及淬灭基团Q同时存在时，无荧光信号释放。当R基团与Q基团分离时，R基团便能产生荧光信号。 PCR扩增时，DNA链合必延长，当遇到与模板DNA结合的探针时，Taq DNApol发挥5 3核酸外切酶活性，将探针5 端的R基团水解下来，产生荧光。由荧光检测系统收集。探针余下部分，继续由Taq DNApol 水解切除。PCR扩增继续向前，直至此循环结束。在下一轮循环，产生上述同样过程，收集荧光信号。 这样，TagMan 探针就在每一轮PCR扩增时，就实时测定PCR产物的量。 14、什么是基因组DNA文库？什么是cDNA文库？ 答：从细胞中提取总基因组DNA，用相应的限制性核酸内切酶酶切，得到大小不同的许多各种基因片段，将这些基因片段分别与相应的基因载体连接重组。于是形成各种重组体，将所有这些重组体转导入合适的受体细胞中，对受体细胞进行培养扩增，从而获得含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体，它可以涵盖该种生物基因组的全部基因信箱，称之为基因组DNA文库。 从细胞中提取mDNA，通过转录得到相应的各种cDNA 。然后将这些cDNA分别与相应的载体连接，得到各种重组cDNA。将所有这些重组cDNA转录入合适的受体细胞内进行克隆培养，从而获得多克隆cDNA 片段的混合体。它包含了一种组织细胞中全部mDNA信息。称之为cDNA文库。 15、什么是基因芯片？什么是蛋白质芯片？ 答：一、基因芯片技术是以反向点杂交为基础而建立的一种高效高通量的自动化分析技术。其基本原理是： 针对各种基因突变类型合成各种探针以及正常探针，但不对它们进行标记。通过自动化微点样技术将这些未标记的探针依次排列布阵在固相支持载体玻片或尼龙膜上。将待测样品DNA进行荧光标记，与固定在固相支持载体上的各种探针进行微杂交，荧光检测系统对芯片进行扫描收集荧光信号，经计算机软件进行比较分析处理，就可得出检测结果。由于探针布阵密集，1cm2 内可布阵数万个基因，同一时间的一次检测可分析大量基因，故称基因芯片。 二、蛋白质芯片 将针对各种不同蛋白质的相应抗体蛋白作为探针，将这些各种蛋白探针用微点样技术布阵在固相支持载体尼龙膜等上面，形成蛋白质芯片。将待测蛋白质进行荧光标记并与芯片上的各种蛋白质探针进行结合反应，于是特异的蛋白质与它特异的抗体之间产生特异的抗原抗体亲和反应而结合。此时芯片上就可产生特定的荧光信号，通过激光扫描收集荧光信号，再经计算机软件处理就可得出检测结果。 第二十一章 DNA重组及DNA重组技术 1、什么是基因克隆？ 答：基因克隆：在体外将目的基因与载体DNA连接起来形成重组DNA，然后采用适当的物理、化学及生物学方法将重组DNA导入合适的受体细胞内，通过对阳性受体细胞进行克隆培养，于是，目的基因在受体细胞内不断地复制得到大量基因拷贝，并转录和翻译出相应的目的蛋白质，这一过程称基因克隆及克隆基因的表达。 2、限制性核酸内切酶的作用特点有哪些？ 答：RE作用于DNA分子内部，使两条单链水解切断，分别产生5-P端 及3-OH端。 RE的识别酶切部位，具有特殊的碱基顺序，通常为4-6个碱基的回文结构，也称反向重复序列。如 Ecor的识别顺序为： 5G A A T T C3 3C T T A A G5 切割方式： 在识别部位，切割DNA双链，产生两种不同的末端： 粘性末端：在识别部位对称的不平齐切开DNA双链，产生单链突出的互补粘性末端： a，若从5 端切割，产生5端突出的粘性末端，如 BamH 5GGATCC3 3CCTAGG5 b，若从3端切