分光光度法测定蔗糖合成酶蔗糖磷酸合成酶酶活性.docx

分光光度法测定蔗糖合成酶蔗糖磷酸合成酶酶活性蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。 蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。 UDPG+果糖-蔗糖+UDP 这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高，细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定，也可以在分解方向进行测定。 蔗糖磷酸合成酶催化UDPG与果糖-6-磷酸结合形成磷酸蔗糖： UPDG+F6P-蔗糖-6-P+UDP+H+ 6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。 一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。 果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。 植物茎 冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平，0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱 1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白，2%PVP，5mmol/LDTT。 2.透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。 3.酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖,2mmol/LEDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。 4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。 5.2mol/LNaOH 6.30%HCl 7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。 8.1mg/ml蔗糖标准液 1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。 2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。 3.蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH 0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCl3.5ml,0.1%间苯二酚1ml，摇匀后于80度保温10min,冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。 4.蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。 5.标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。 管号 试剂 1 1mg/ml蔗糖标准液 蒸馏水 .0 蔗糖含量 0 .1 A480 1.9 0.2 0 .1 0.8 0.4 2 0.2 0.6 0.6 3 0.4 0.4 0.8 4 0.6 0.2 0.0 15 0.8 06 0.0 0 7 16.结果计算：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖/(g*FW*L) 酶活力=C*Vt*n/(FW*t*Vs) 式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量；FW是样品鲜重;t是反应时间；Vt是提取酶液总体积；Vs是测定时取用酶液体积；n是提取液测定中的稀释倍数。 透析袋不可装满，以防止吸水涨破。 蔗糖是重要的光合产物，为植物体内运输的主要物质，又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶、是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内的功能有所不同。蔗糖合成酶以游离果糖为受体，蔗糖磷酸合成酶以果糖-6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸，在蔗糖磷酸合成酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG是合成蔗糖的葡萄糖供体，故催化UDPG合成的UDPG焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。 蔗糖的合成： 1、蔗糖合成酶 UDPG+果糖 蔗糖+UDP 2、磷酸蔗糖合成酶 UDPG+F-6-P 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O 蔗糖+Pi 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂 HEPES-NaOH缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP； 0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取0.5g样品，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。 2、酶活性测定 依次加入 50L粗酶液， 50LHepes-NaOH缓冲液pH7.5， 20L 50 mmol/LMgCI2， 20L 100mmol/L UDPG， 20L 100mmol/L6-磷酸果糖， 30中反应30min后，加入200L 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1%间苯二酚，摇匀后置于80水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作： 取0、40、80、120、160、200g/ml的蔗糖溶液50L，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。 4、计算 样品中酶活性= 式中 C反应液催化产生的蔗糖总量； V1提取酶液时加入的缓冲液体积；