人免疫球蛋白G ELISA检测方法及步骤.docx

人免疫球蛋白G ELISA检测方法及步骤人免疫球蛋白G(IgG) ELISA检测方法及步骤 人(Human) 免疫球蛋白G (IgG) ELISA检测试剂盒 本试剂仅供研究使用 标本：血清或血浆 试验原理： IgG试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知IgG浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将IgG和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中IgG的浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份(2-8保存)96孔配置48孔配置配制 96/48人份酶标板1块板(96T)半块板(48T)即用型 塑料膜板盖1块半块即用型 标准品：80g/L1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按说明书进行稀稀 空白对照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型 标准品稀释缓冲液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型 生物素标记的抗IgG抗体1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型 亲和链酶素-HRP1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型 洗涤缓冲液1瓶(20ml)1瓶(10ml)按说明书进行稀释 底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型 底物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型 终止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型 标本稀释液1瓶(12ml)1瓶(6.0ml)即用型 自备材料 信息来源环保英才网： 1蒸馏水。 2加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 2实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 3不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 操作注意事项 1试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 5使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 样品收集、处理及保存方法 1、血清-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、血浆-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、细胞上清液-1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4、组织匀浆-将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液 信息来源环保英才网： 5、保存-如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 试剂的准备 1标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行： 80 g/L(6号标准品)原倍浓度不用稀释直接加入50ul。 40 g/L(5号标准品)100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液 20 g/L(4号标准品)100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液 10 g/L(3号标准品)100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液 5.0 g/L(2号标准品)100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液 2.5 g/L(1号标准品)100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液 0 g/L(空白对照)原始浓度不用稀释直接加入50ul。 2洗涤缓冲液(50×)的稀释：蒸馏水50倍稀释。 操作步骤 1使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 2根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。 3加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育1小时。 4甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3信息来源环保英才网： 次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。 6甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37温育10分钟。避免光照。 8取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9在450nm波长处测定各孔的OD值。 信息来源环保英才网：