TUNEL 法测凋亡操作步骤.docx

TUNEL 法测凋亡操作步骤TUNEL 法测凋亡操作步骤 一、TUNEL检测原理 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本和细胞样本的凋亡原位检测。 其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL，可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺的存在下，显示为棕色，特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。 二、试剂盒组份 组 份 10 assays 25 assays 储存条件 A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 L 25 L -20 C：TdT Enzyme 10 L 25 L -20 D：500×Proteinase K 10 L 25 L -20 20×SSC 15 mL 38 mL 4 E：Streptavidin-HRP 10 L 25 L 4 F：20×DAB Substrate Buffer 50 L 125 L 4 G：20×DAB Chromogen 50 L 125 L 4 H：20×Hydrogen Peroxide 50 L 125 L 4 三、操作流程 1.操作流程概览 2.细胞样本制备 准备： PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制； 操作步骤： 1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干； 2)室温固定15min30min；PBS漂洗3×5min； 3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min； 4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec2min； 5)进行标记反应。 3.石蜡包埋组织切片预处理 准备： 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10min，梯度乙醇水合； 蛋白酶K工作液：2 L500×蛋白酶K + 998 L PBS； 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。 操作步骤： 1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水； 2)PBS漂洗3×5min； 3)加入蛋白酶K工作液，37反应1530min；PBS漂洗3×5min； 4)室温固定15min30min；PBS漂洗3×5min； 5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min； 6)进行标记反应。 4.冰冻组织切片预处理 准备： 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制； 封闭液：3%H2O2溶于甲醇； 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制； 操作步骤： 1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min； 2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min； 3)浸入通透液中，室温30sec2min； 4)进行标记反应。 5.阳性对照和阴性对照的准备 TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。 1)阳性对照样本的处理 DNaseI反应液： 组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 L DNaseI反应液，室温孵育1030min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。 2)阴性对照样本的处理 在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。 四、标记和显色反应 以下操作在湿盒内进行。 1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体； 2.每个样本滴加100 L TdT酶反应液，于37#61616;C避光反应60min； TdT酶反应液的准备： 成分 标准100 L/片 切片数 总体积 Equilibration Buffer 98 L × = Biotinylated Nucleotide Mix 1 L × = TdT Enzyme 1 L × = 阴性对照片不加TdT酶。 3.用去离子水按1：10稀释20×SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗3×5min； 4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育35min；PBS漂洗3×5min； 5.滴加100 L Streptavidin-HRP工作液，于37反应3060min； 6.PBS漂洗3×5min； 7.滴加DAB显色液： 成分 100 L/片 切片数 总体积 20×DAB Substrate Buffer 5 × = 20×DAB Chromogen 5 × = 20×Hydrogen Peroxide 5 × = ddH2O 85 × = 8.用去离子水漂洗数次； 9.中性树胶封片，显微镜下观察。 注意事项： 1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应； 2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败； 3.TdT酶反应液应即用即配，在冰上进行，不宜长期保存； 4.复染细胞核可以用甲基绿染液。