Sephadex LH20的分离原理.docx

Sephadex LH20的分离原理Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见，先用50氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。 流速不可太快，切切不可性急，所谓欲速则不达。柱子尽可能长， Sephadex LH20柱长的增加将极大地改善分离，不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。要集中优势兵力，打击敌人。馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。Sephadex LH20对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。 对Sephadex LH20上样样品的要求是1、样品一定要溶解。2、溶解样品的体积尽可能小3、样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同。以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱，样品用最少体积的甲醇-水溶解”，请注意我的陈述是“尽可能”。 样品经过分离一般而言会产生两种结果：1、目标组分的相对纯度提高，因为经过分离后各组份分别在不同的馏分富集，当然在富集目标组分的馏分中目标组分的含量要比总样中的含量要高，所以我们说目标组分得以纯化。2、目标组分的绝对量减少，因为无论是什么分离手段，物质的分离总会有交叉，意即不但目标组分分布于主要富集目标组分的馏分中，相邻馏分中也定会有它的踪影，只是可能不是相邻馏分的主成分，从分离的角度，那些相邻馏分并非是我们想要的，我们只将目标组分的相对含量高的馏分用于下一步分离，这种结果必然是与原样相比用于下一步分离的馏分中目标组分的绝对量要少一些。 如果Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤， 将柱头堵住，或由于样品的死吸附，使柱子的柱头部分污染，一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去，具体做法很简单，只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可。如果柱子整个被污染，如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下：依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上，所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。