MTT法检测细胞活力与细胞密度的关系.docx

MTT法检测细胞活力与细胞密度的关系细胞生物学实验 MTT法检测细胞活力与细胞密度的关系 一、 实验目的 学习用MTT的方法检测细胞活力的原理。 二、 实验原理 活细胞的线粒体脱氢酶可以还原黄色的MTT溶液为紫色甲臜颗粒，沉积在细胞中；用DMSO等试剂溶解甲臜后的溶液在一定波长下比色测定的吸光值与活细胞数量及代谢活性成正比。 三、 实验试剂及仪器 a) 材料：小鼠腹水瘤小鼠 b) 试剂： i. D-Hanks液。 ii. 0.4台盼蓝生理盐水染液。 iii. 含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液。 iv. 5mg/ml 的MTT：用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液配制，溶解后过滤消毒，4避光保存。 v. 盐酸-异丙醇裂解液：量取盐酸14mL、Triton X-100溶液50mL，加异丙醇至500mL。 c) 用品：酶标仪、CO2培养箱、10mL低速离心机、血球计数板、96孔培养板、小剪刀、镊子、10mL带盖刻度离心管、100mL枪及枪头等 四、 实验步骤 加MTT反应溶解甲臜测定溶液吸光值。 权宜操作流程：MTT与细胞作用计数细胞调浓度将细胞悬液加样于96孔细胞培养板溶解甲臜测定溶液吸光值。） a) 加MTT，37温育 b) 计数细胞调浓度。 6 10个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5× 105 个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5× 104个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5× c) 加样：空白对照和实验，每孔100L ，2个重复孔。 d) 加裂解液：MTT作用4h后，加裂解液，混匀。 e) 比色：酶标仪，570nm波长 f) 吸光值计算：实测OD值-空白对照孔OD平均值 g) 分析： OD值与细胞浓度的线性关系范围 五、 实验结果 六、 实验分析 细胞生物学实验 本实验，我一共做了四个图，其中包括：一个以菌液浓度从0.5*104个/ml到1*105个/ml的图；一个以菌液浓度从1*105个/ml到1*106个/ml的图；一个以菌液浓度从1*106个/ml到8*106个/ml的图；以及一个包括所有菌液浓度的图。 从第一个图中可以看出，在菌液浓度从0.5*104个/ml到1*105个/ml的范围内，MTT培养液组的R2=0.3188,，所以其线性关系极差，而MTT缓冲液组的R2=0.7747，所以它的线性关系也不是非常好。 从第二个图中可以看出，在菌液浓度从1*105个/ml到1*106个/ml范围内，MTT培养液组的R2=0.9824,，所以其线性在这个浓度范围内应该是非常好的啦，MTT缓冲液组的R2=0.9658，所以它的线性关系在这个浓度范围内也是非常明显。 从第三个图中可以看出，在菌液浓度从1*106个/ml到8*106个/ml范围内，MTT培养液组的R2=0.7175,，所以其线性在这个浓度范围内不是很好，MTT缓冲液组的R2=0.986，所以它的线性关系在这个浓度范围内也是非常明显。 从第四个图中可以看出，在整个浓度范围内，MTT培养液组的线性关系明显没有MTT缓冲液组好。 最后基本可以得出结论：对于MTT培养液当中的菌活力检测，基本上是在菌液浓度在1*105个/ml到8*105个/ml的范围内线性关系较好，检测较为准确。而在MTT缓冲液当中的菌的活力检测，在1*105个/ml到8*106个/ml的范围内的线性关系都比较好，用于检测比较可靠。 七、 实验注意事项 a) MTT致癌、见光易分解，操作应注意。 b) 细菌对MTT敏感，注意无菌操作。 c) 材料细胞来源的一致性。 d) 鼠腹腔白细胞对实验结果的系统影响。 e) 甲臜溶解应完全并减少气泡的产生。