Mtt说明说和使用方法.docx
Mtt说明说和使用方法产品简介： 1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。 2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。 3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。 4. 本产品为500 次操作。 产品内容： MTT染色液 5ml Formazan溶解液 55ml 说明书 1份 保存条件： MTT染色液需-20避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。 注意事项： 1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32 个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了 2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25水浴温育片刻至全部融解后使用。 3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。 5. 孵育时，须避光 6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。 使用说明： 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，。 2. 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底。加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，每孔0-10ul，设3-5个复孔.建议设5个。 3. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入10微升MTT染色液，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 每孔加入100微升Formanzan溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm测定吸光度。如无570nm滤光片，可以使用560-600nm的滤光片。 6. 同时设置调零孔，对照孔 MTT法 1、什么是MTT法?又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 2、MTT法 - 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 3、 MTT法 - MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 4、MTT法 - 注意事项 MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 5、MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 6、MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60水浴助溶。 PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调pH 7.4 定容1L MTT法 - MTT法实验步骤 贴壁细胞： 1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，。 2.、5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4、每孔加入20ulMTT溶液，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5、终止培养，小心吸去孔内培养液。 6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7、同时设置调零孔，对照孔 悬浮细胞： 1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓(储存液100 1640）。mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul，共100ul加入到96孔板。每板设对照培养基40ul ；加Actinomycin D10ul用培养液稀释 l 2、置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul MTT溶液，继续培养4 h。，直接酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值） 4、离心，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。 5、同时设置调零孔，对照孔，每组设定3复孔。
