免疫学检测技术的基本原理--ppt课件.ppt

第二十二章 免疫学检测技术的基本原理p229,一.体外抗原抗体反应的特征 1.高度特异性 抗原的表位与抗体的抗原结合点结构互补。2.可见性 抗原与相应抗体结合后能肉眼直接观察。二.抗原抗体反应的影响因素 1.温 度：最适温度为37。2.酸碱度：最适pH=6-8。3.电解质：可促进抗原与抗体的结合。常用生理盐水。,抗原抗体比例对反应现象的影响,三.检测抗原和抗体的体外试验（一）凝集反应 颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体 结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。1直接凝集试验（1）玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，细菌的鉴定、分型等。（2）试管凝集试验：用于定量测抗体 如肥达氏反应。2间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。,（二）沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与 相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故 又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。,1单向免疫扩散 用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。,2双向免疫扩散 主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析。,3免疫电泳 其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断。,4免疫比浊 用于定量测抗原。该法快速、简便。,5）免疫比浊法,在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，绘制标准曲线并根据反应液体的浊度，推算样品中的抗原含量。,（三）免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体（或抗原）的免疫学特性，且极大的提高了 反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性 或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术 免疫酶技术 同位素标记技术,1免疫荧光技术(Immunofluorescence Technique)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。（1）常用荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。（2）方法*直接荧光法：优点-特异性强 缺点-每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。*间接荧光法 优点-敏感性比直接法高，且制备一种荧光素标记的二抗可 用于多种抗原的检测，缺点-非特异性荧光增加。,2酶免疫测定（Enzyme Immunoassay,EIA）用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。其检测的敏感度可达pg-ng/ml水平。Ab+E AbE Ag+AbE AgAbE+底物 呈色反应,EIA,（1）标记的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除.用于可溶性抗原和抗体的检测。,*间接法：用于检测抗体,*双抗体夹心法：用于检测抗原。,B 免疫组化技术检测组织中或细胞表面的抗原。对抗原进行定性、定量、定位检测。C 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）可用于细胞因子的检测,3放射免疫测定法（RIA）敏感度可达pg水平，其标记物为125I、131I等。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。,4化学发光免疫分析 该法是将发光物吖啶酯、或鲁米诺标记抗原或抗体进行的结合反应。发光物质在反应剂激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出光子，用自动发光分析仪能接收光信号，测定光子的产量，以反映待检样品中抗体或抗原的含量。其灵敏度高于RIA，常用于超微量物质的测定，如甲状腺素等。,5免疫印迹法（Western blotting）该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种病毒的抗原或抗体。如检测HIV抗体。,免 疫 印 迹 法 示 意 图,HIV的免疫印记,免疫胶体金技术,