标-记-免-疫-技-术ppt课件.ppt

标 记 免 疫 技 术邹全明第三军医大学医学检验系临床微生物学和免疫学教研室,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,标记免疫技术,酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术化学发光技术金免疫技术生物素-亲和素免疫放大技术,第一节 酶免疫技术,基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。,基本特点：标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。酶促反应专一性，保证特异性。底物反应放大作用，提高敏感性。酶标试剂保存稳定。操作简便，安全易行。,一、酶免疫技术的分类,酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定（ELISA）液相酶免疫测定,二、酶免疫技术的技术要点,（一）固相载体基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。,种类与选择1.塑料制品2.微颗粒3.膜载体,（二）酶与酶作用底物,1.用于标记酶的要求：酶活性高标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性酶催化底物后信号易判定或测定酶活性不受样品中其他成分的影响酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉,2.常用酶及其底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）常用底物：邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。,（2）碱性磷酸酶（AP）常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。*AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率 低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。,（三）酶标记抗体或抗原基本要求：酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。,酶标记方法 1.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。2.直接法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。,（四）标记抗体鉴定（五）免疫吸附剂（六）试剂最佳工作浓度的选择,三、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),(一)基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）,（二）ELISA技术类型：,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。,1双抗体夹心法,特点：非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,2间接法,3.竞争法,特点：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。,4.捕获法（反向间接法）,主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。,注意事项：,加样 应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。保温 1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。,洗涤：决定着实验的成败。目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。,比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。,四、均相酶免疫吸测定,基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于小分子抗原或半抗原的检测.,(一)酶扩大免疫测定技术:（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）,基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。,（二）克隆酶供体免疫测定（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA）,利用重组DNA技术制备-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzyme acceptor,EA），小片段称为酶供体（enzyme donor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。CEDIA的反应模式为竞争法。,基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比。,五、固相膜免疫测定,固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。类型：免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式 斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）免疫印迹法(Western blot),（一）斑点ELISA(dot-ELISA),（二）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）,亦被称为Western blot分三个阶段进行:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电转移 酶免疫定位,免疫印迹法原理示意图,第二节 荧光免疫技术,免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。,基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。,一、免疫荧光显微技术,（一）基本原理：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。,（二）荧光抗体的制备,（1）荧光抗体的标记作为标记的荧光素应符合以下要求：应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。标记方法简单、安全无毒。,荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC）四乙基罗丹明（RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记方法：搅拌法(适合大样品)透析法(适合小样品)标记抗体的纯化：透析法、层析分离法,（2）荧光抗体的鉴定,F/P比率：将制备的荧光抗体稀释至A2801.0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰。,F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以F/P1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P2.4为宜。,抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想。抗体特异性：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光。,（三）技术类型,直接法,优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少。缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。,间接法,优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,（四）荧光免疫显微技术在 医学检验中的应用,1血清中自身抗体的检测2各种微生物阶快速检查和鉴定3寄生虫感染的诊断4白细胞分化抗原的检测5人类白细胞抗原(HLA)的检测6肿瘤组织中肿瘤抗原的检测7组织中免疫球蛋白和补体组分的检测8激素和酶的组织定位,二、荧光免疫测定技术,荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据抗原抗体结合后是否需要将结合状态与游离状态的的荧光标记抗原（或抗体）分离开，而将之为均相和非均相两种类型。,(一)时间分辨荧光免疫测定,1.基本原理时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)是荧光分析（FIA）的基础上，用具较长寿命荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的作为标记物来标记抗体或抗原，从而检测标本中的相应抗原或抗体的新技术。,2.技术类型,(1)固相双位点夹心法(2)固相抗原竞争法(3)固相抗体竞争法,(二)荧光偏振免疫测定,FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。其原理是：标本中的抗原与荧光标记的抗原竞争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。,第三节 放射免疫技术,放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA）广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、重复性好等,一、放射免疫分析（RIA）,基本原理 采用定量的标记抗原（Ag）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。,二、免疫放射分析（IRMA）,基本原理单位点IRMA：利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。,双位点IRMA 先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃反应液中剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。,IRMA与RIA的异同点,1.标记物2反应速率3反应原理4特异性5灵敏度和检测范围6分析误差,第四节 发光免疫技术,发光免疫技术(luminescence immuno-technique)是将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。,根据发光免疫技术中发光标记物不同，分为三种类型。化学发光免疫分析(chemiluminescence immune assay，CLIA)化学发光酶免疫分析(luminescence enzyme immunoassay，IEIA)生物发光免疫分析（bioluminescence immunoassay，BLIA）,一、发光与发光底物,（一）发光（二）光照发光（三）生物发光（四）化学发光 氨基苯二酰肼类、吖啶酯（acridiniumester，AE）类,二、化学发光标记技术,（一）发光标记法的分类生物标记法（直接合成法）直接化学发光剂物质标记法（直接偶联法）催化剂和协同因子标记抗原抗体法（间接偶联法）,（二）标记方法碳二亚胺（EDC）缩合法重氮盐偶联法（重氮化法）过碘酸盐法戊二醛法琥珀酸酐法异硫氰酸酯衍生物法O-（羧甲基）羧胺法,第五节 金标记免疫技术,金标记免疫技术（immunogold labeling technique）是以胶体金作为标记抗原或抗体，检测样品中抗体或抗原的性质、含量、形态学特征等进行分析的综合技术。它是利用金颗粒光学检测的灵敏性与免疫反应的特异性相结合的一种技术。,一、胶体金的特性,（一）胶体特性（二）光学特性（二）稳定性（三）溶胶的聚沉现象,二、胶体金标记技术的类型,（一）斑点金免疫渗滤试验 1.原理 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay，DIGFA)是以NC膜为载体，包被抗原或抗体于渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的(一般5min左右完成)。,2.技术类型,（1）双抗体夹心法（2）间接法,金免疫渗滤装置示意图,（二）斑点免疫层析试验,1.原理 斑点免疫层析试验（dot-immunochromatographic assay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以NC膜为载体，但利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判断实验结果。,2.技术类型,（1）双抗体夹心法（2）竞争法（3）间接法,免疫层析试验原理示意图,第六节 生物素-亲和素 免疫放大技术,生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。,一、生物素-亲和素系统的特点,生物素（biontin，B）由卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD生物素分子有两个环状结构 环为咪唑酮环，与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他 生物大分子的惟一结构，经化学修饰后成 为活化生物素。,亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素由卵白蛋白中提取，4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD耐热井耐受多种蛋白水解酶的作用尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，因此二者的结合特异性高和稳定性好。,BAS特点：灵敏度形成的生物素衍生物，保持原有生物活性，比活度高，具多价性。每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可 同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生 物和标记物。具有多级放大作用，提高灵敏度。,特异性 具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性；不会因反应试剂的高度稀释而受影响，可最 大限度地降低反应试剂的非特异作用。稳定性 亲和常数极高，解离常数很小，反应不可逆；酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂 均不影响其结合。,适用性 可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技 术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗 原-抗体、激素受体和核酸系统以及其他多 种生物学反应体系，可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应 体系中的反应物。其他 可制成多种通用性试剂，实验成本低；结合具高速、高效的特性，所需的温育时间 短，实验往往只需数小时即可完成,二、生物素的理化性质与标记,生物素及其活化 生物素经活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。常用的活化生物素的标记制备方法 标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素,生物素化蛋白质衍生物 特性：一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，具 较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多 价。生物素化大分子的多价性，是BAS多级放 大作用的物质基础。类型：（二类）生物素化的大分子生物活性物质 如：抗原、抗体等 标记材料结合生物素后制成的标记物 如：酶类等,蛋白质生物素标记注意事项：应根据抗原或抗体分子结构中基团种类（氨基、醛基或巯基）及分子理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。控制每个蛋白质分于上标记的生物素分子数量在一定范围，以免影响标记物活性。在生物索与被标记物间加入交联臂样结构，减少大分于物质造成的空间位阻，利于结合。生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后应不影响后者的免疫活性。,三、亲和素、链霉亲和素的理化性质 与标记,亲和素及其活性 亲和素在纯水中的溶解度类似于球蛋白，而在50硫酸铵溶液中的溶解度又与白蛋白相似，亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关，是亲和素与生物素咪唑环酮结合的基团。,链霉亲和素及其活性 链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉 菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，甘氨 酸和丙氨酸的含量较大，结合生物素的活性 基团是肽链中色氨酸残基；与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结 合4个生物素分子。链霉亲和素可在N端1012和端19-21间断 裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的 结合生物素的能力。,亲和素（或链霉亲和素）的标记 几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素（AV）或链霉亲合素（SA）结合。小分子的有125I、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质有酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金。,四、生物素-亲和素系统的应用,生物素-亲和素系统（BAS）被广泛应用于各种生物医学实验方法。在多种自动化免疫分析技术领域中的应用。在核酸探针标记；细胞和生物活性物质分离提纯等方面也显示了明显的优越性。,生物素亲和素系统基本类型及原理基本类型有二种：以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待捡反应体系和标记生物素，称为BAB法（biotin-avidin bindBAB）；后来又在此基础上发展了亲和素生物素化酶复合物技术，称为ABC法（avidinbiotin-peroxidaes complex，ABC）。直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素生物素法（Labeledavidin-biotin，LAB）。,BAB法原理：也称桥连亲和素-标记生物素法（BRAB）Ag+BAb Ag-AbB A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E,BAB法 原理示意图,BA法原理：Ag+BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-A-BE 特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省却了 加B-E的步骤,BA法 原理示意图,ABC法：A+BE A-BE-ABC Ag+BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-ABC 特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC,ABC法 原理示意图,方法应用,BSA在酶免疫测定中的应用BSA在荧光免疫技术中的应用BSA在放射免疫测定中的应用BSA在分子生物学中的应用,谢谢！,