法医学 法医DNA分型课件.ppt

第,18,章,法医,DNA,分型,法医物证学,基本概念：,对涉及法律问题的生物性检材进行检验，解决,个人识别和亲权鉴定问题的法医学分支学科,基本任务：,个人识别,-,揭示个体身份,亲权鉴定,-,判定备检者之间是否存在生物学亲缘关系,一、基本概念：,1.,基因,(gene),：,染色体上一段,特定的,DNA,片段。,2.,基因座,/,位点,(locus),：,基因在染色体上的,特定位置,。,3.,等位基因,(allele):,一个基因座上的基因存有,DNA,一级结,构差异。,4.,基因型,(genetype),：,基因座上成对,等位基因的组合,。,5.,表型,(phenotype),：,通过一定手段观察到的个体性状。,法医常用遗传标记,遗传标记的检测方法：,?,血清学方法,检验红细胞血型、白细胞血型、红细胞,酶型、血清型,?,DNA,检验技术,RFLP,技术、,PCR,技术,二、,DNA,水平的遗传标记,1,、,DNA,的分子结构,DNA,的二级结构,-,双螺旋结构,1953,年，,Watson,和,Crick,提出了,DNA,双螺旋结构模式。,变性：双链间氢键的断裂，形成两条多核苷酸单链的过程,引起,DNA,变性的因素主要有高温、强酸强碱、,有机溶剂等。,DNA,变性后，性质发生改变。,核酸分子杂交,(hybridization),根据核酸分子变性及复性的性质，,通过碱基配对使,不同来源,的两条多核苷,酸链相互结合。,在某些因素的影,响下，例如紫外线、,DNA,酶等，可以使,DNA,分子中的,磷酸,二酯键断裂,，形成,多个分子量更小的,DNA,片段，这个过,程叫作,DNA,降解。,2,、,DNA,多态性,等位基因（或,DNA,片段）存在,两种以,上,形式，且每种等位基因,频率,0.01,，,本质为碱基构成发生改变（点突变、缺,失、插入或置换），分为,长度多态性,和,序列多态性。,DNA,长度多态性,由同一基因座上各等位基因之间,DNA,片段长度差异构成的多态性。,DNA,序列多态性,基因组,DNA,核苷酸序列在个体排列上,存在巨大差异，这种差异形成,DNA,片,段序列多态性。,单核苷酸多态性（,SNP,）,人类基因组范围,内，如果任何单,碱基突变使,特定,核苷酸,位置上出,现,两种,碱基，其,中最少的一种在,群体中的频率不,少于,1%,小卫星,DNA,：,一类由,10-100bp,长度重复单位形成,的卫星,DNA,，序列总长度,100-20kb,，,又称可变数目串联重复序列,（,VNTR,）,形成机制主要是不等交换,微卫星,DNA,：,一类由,2-6bp,长度重复单位形成的卫星,DNA,，串联重复,10-60,次,，总长度多,小,于,300bp,，,又,称,短,串,联,重,复,序,列,（,STR,），,形成机制主要为复制滑脱,线粒体基因组（,mtDNA,）,?,母系遗传,?,单倍型遗传,?,多拷贝,?,突变率高,?,高度多态性,?,异质性,3,、,DNA,多态性检测技术,限制片段长度多态性（,RFLP,）,限制性内切酶：识别双链,DNA,分子中特定核苷,酸序列，并在特定部位以内切方式水解,DNA,链,的核酸水解酶。,由于,DNA,限制酶识别的序列核苷酸结构发生,改变，导致酶切位点的产生、消失或移位，,酶切,所产生的限制性片段数目和长度改变,所呈现出的,DNA,多态性。,RFLP,试验流程图,DNA,纹印：,RFLP,分析杂交时使用,单基因座探针，高度,严格杂交条件下，仅,与一个小卫星基因座,等位片段杂交，形成,单基因座,RFLP,图谱。,DNA,指纹：,RFLP,分,析,杂,交,时,，,使用多基因座探针，,不严格杂交条件下，,与多个小卫星基因,座等位片段杂交，,形成多基因座,RFLP,图谱。,英国科学家,Jeffreys,采用,PCR,扩增,VNTR,或,STR,基因座等位基,因进行,DNA,长度多态性分析,的方法。,扩增片段长度多态性分析（,amp-FLP,）：,聚合酶链式反应,(PCR),原理：,模拟天然,DNA,复制的体外,DNA,扩增,方法。以基因组,DNA,为模板,以一对寡核,苷酸为引物,dNTP,为原料,在耐热多聚酶存,在下，反复经过,变性、退火、引物,延伸三,个步骤,使靶,DNA,片段得到复制。,变性,(denaturation),：,加热至,95,，使模板,DNA,双链,的氢键断裂而解离成两条单链。,退火,(annealing),：,降温至,55,左右，引物寡核苷酸,与模板,DNA,互补序列复性，形成模板,-,引物杂交双链。,两引物的,3,端彼此相对。,延伸,(extension),：,升温至,72,，在耐热,DNA,聚合酶的,作用下，以碱基配对原则，,dNTP,逐个连接在引物的,3,端。引物由,5,端,3,端方向被延伸、合成与靶,DNA,序列互补的,DNA,新链。,经过,变性,?,退火,?,延伸,的一次循环，靶,DNA,片段被,复制一次。新合成的,DNA,链又可成为下一循环的模,板。经过,n,次循环后，产生在两引物间的靶,DNA,短,片段数量为,2,n,-2n,条。,30,次循环后，理论上,DNA,拷,贝数可达,10,5,-10,7,。,PCR,产物经电泳分离，显带,杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段；,根据片段长度判定等位基因和基因型,1.,高灵敏度，适于陈旧、降解、腐败检材；,2.,特异性高；,3.,可复合扩增；,4.,种属特异性；,5.,实验周期短，设备条件和操作相对简单。,PCR,技术用于法医学的特点,短串联重复序列（,STR,）：,广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态,性的,DNA,序列，基序为,2-6bp,，串联重复,10-60,次,，总长度多小于,300bp,，形成机制主要为复制,滑脱。,STR,基因座命名原则：,?,编码区，依据所在基因名称命名,?,非编码区，依据首次进入公共数据库的序号命,名,STR,基因等位基因命名原则：,?,等位基因根据所含重复单位数目命名等位基因。,?,含有不完整基序的等位基因命名：在完整等位基,因数后面加一小数点，小数点后面为不完整序列,含有的碱基数。,Ladder,5-12,Ladder,5-12,Ladder,5-12,1 2 3,4 5 6,基因型,1:(8,8);2:(8,10),3:(8,8);4:(7,9),5:(8,8);6:(8,9),CSF1PO,D5S818,D21S11,TH01,TPOX,D13S317,D7S820,D16S539,D18S51,D8S1179,D3S1358,FGA,VWA,AMEL,AMEL,性别基因,美国联合,DNA,检索系统,（,CODIS,）的,13,个,STRs,应用于法医的,STR,应满足以下条件,?,PCR,扩增产物长度在,300bp,以下,?,宜选择四核苷酸,STR,基因座,?,选多个,STR,基因座应不在同一条染色体上,?,每个,STR,基因座等位基因数,8-10,个左右,?,基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现,?,杂合度高，最好大于,0.80,；,?,低突变率,0.2%,。,多基因座复合扩增,（,multiplex amplification,）,?,在一个,PCR,体系中同时扩增多个基因座,?,如果同时检测,8,16,个,STR,基因座，鉴别能力,能够达到,DNA,指纹的水平。,?,优点：高效、经济、快速。,?,目前常用的复合扩增方法有两种：,银染系统、多色荧光自动检测系统,银染系统,多基因座复合扩增产物电泳分离后，,PAG,凝,胶直接用银染显带。体系中多个基因座的基,因长度范围必须,互不重叠,。,操作简单，经济实用。因为片段长度范围,选择受限制，能够同时扩增的基因座个数有,限。,荧光标记的自动检测系统,常采用复合扩增即在同一反应管中同时,扩增多个,STR,基因座，自动化的激光荧光检,测系统进行,PCR,产物分型,原理：,荧光染料标记在一条,PCR,引物的,5,端，在,PCR,扩增时，,PCR,产物带上荧光标记。,电泳时，标记有荧光染料的,DNA,片段由激光,诱发荧光而被检测。,D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,TH01,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,D18S51,TPOX,VWA,AMEL,D5S818,FGA,GS500 LIZ size standard,6FAM,(blue),VIC,(green),NED,(yellow),PET(red),LIZ(orange),AmpFlSTR,?,Identifiler?,法医遗传学应用,STR,的特点在于：,?,高灵敏度,?,扩增的片段短,?,使用生物检材类型广泛,?,分型简单，可标准化,?,染色体定位明确,PCR-STR,：国内外法医个人识别和亲子鉴定的主流技术,长度多态性分型局限性,案发现场只发现有头发或长期暴露,于外界环境的骨骼，这些检材中核,DNA,含量很少或降解,，无法进行长度多态性,（如,STR,）分型。,?,PCR-ASO,技术,HLA-DQAl,基因座,?,PCR-RFLP,技术,ABO,基因、,mtDNA,?,DNA,序列分析,mtDNA,分型,法医学上常用的序列多态性分析技术,PCR-RFLP,技术,利用两个片段之间的序列差异，而且这,种,差异刚好构成一个限制性核酸内切酶识别,位点,，或使原有的限制酶识别位点丢失或识,别位点移动了位置，选择合适的限制酶切割,PCR,产物，从长度不一的,DNA,酶切片段，可,以判断等位基因及基因型。,DNA,序列分析,（一）,Sanger,双脱氧末端终止法,（二）循环测序,（,cycle sequencing,）,（三）,荧光标记循环测序全自动分析,排除,不排除,/,认定,个人识别的,系统效能,遗传标记,同一人？,未知样本,Q,已知样本,K,个人识别能力,(discrimination power,DP),：,指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型,不相同,的概率。,?,评价该遗传标记系统识别无关个体效能大小的指标，,即反应遗传标记区分不同人的能力；,?,遗传标记的多态性越高，个人识别能力越强，遗传,标记的效能就越高。,遗传标记个人识别的系统效能,计算公式,式中,n,为一个遗传标记的表型数目，,Pi,为群体,中第,i,个表型的频率。,Pi,2,为人群中随机抽取,的两个样本，纯粹由于机会而一致的概率,(Q),。,累积个人识别能力（,TDP,）,遗传标记数目越多，个人识别能力愈强。,提高系统的个人识别能力可以通过增加检测的遗传标记,数目来实现。若检测,k,个遗传标记，其累积个人识别能力,计算公式为：,一名随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配,的,可能性,，又称为随机匹配概率或随机个体碰巧匹,配概率。,是对一个特定的（组合）遗传标记表型可能出,现在人群中的概率，也可以说是从一个人群中随机,抽取一个样本，会出现特定表型的理论概率。,匹配概率,（,probability of match,Pm,）,Pm,的意义,?,当两份检材的遗传标记表型匹配时，如果现场检,材不是嫌疑人留下的，而是一个从,群体中随机抽,出的个体,留下的，遇到这种个体的,可能性有多大,。,?,这个概率越小，遇到这种个体的可能性就越小，,说明现场检材与嫌疑人样本的表型匹配非常不像,是一个随机事件，而是,支持这两个样本来自同一,个人的假设,，也就是支持现场检材是嫌疑人留下,的假设。,似然率（,likelihood,LR,）,似然率基于两个表型组合来自同一个体的假设衡,量证据的强度。,?,例如，现场血痕,DNA,和嫌疑人血液,DNA,表型组合均为,X,，,可以考虑两种假设：现场血痕是嫌疑人所留（原告假,设）,；现场血痕是一个与案件无关的随机个体所留,（被告假设）。,?,似然率是假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型,组合都,是,X,的概率,Pr,（,E,Hp,）,=1,；与假设条件下现场血,痕与嫌疑人的表型组合都是,X,的概率（,Pr,（,E,Hd,）,=,P,（,X,）,之,比，即,LR=1/,P,（,X,）,谢,谢！,