植物基因工程课件.ppt

植物基因工程,转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但现在该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。,第一节 植物基因的克隆与分离第二节 植物基因工程研究常用的基因第三节 植物基因转移的病毒载体第四节 植物基因转移的质粒载体第五节 植物基因转化方法第六节 转基因植物的检测鉴定,第一节 植物基因的克隆与分离,一、根据基因的功能分离目的基因,但在任何类型的细胞中，都仅有少数的基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还会随着发育阶段及环境因素的变化而变化。因而单从蛋白质水平出发分离目的基因，显然是存在着相当的难度和一定的局限性。,一种比较有效的分离高等植物基因的策略，它涉及目的基因编码产物蛋白质的分离、纯化及突变体表型的互补克隆。,在纯化相应的编码蛋白后，构建cDNA文库或基因组文库，DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行：,将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因；(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。,从蛋白到DNA,二、根据mRNA特异分离目的基因,mRNA差别显示技术、cDNA代表性差示分析（RDA）,2.mRNA差别显示的技术 1993年，由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所工作的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee建立。,1.mRNA差减杂交(subtractive hybridization)技术，又叫差减cDNA克隆 根据不同材料mRNA种类的差别分离目的基因。只适用于缺失突变体，在很大程度上受生物体核DNA复杂性的影响，而且又存在着实验周期长、重复性差、效率低等缺点。1992年，美国哈佛大学的F.M.Ausubel实验室，应用该法从拟南芥菜中克隆到了一个与植物茎杆高度相关的基因，这可能是已见报道的为数不多的典型例子之一。,3.cDNA代表性差示分析(representational difference analysis)技术，cDNA RDA,1994年 M.Huband和D.G.Scatz在N.Lisitsyn 等人的基础上，发展了一种用于克隆差别表达的基因的方法。此法保留了差减杂交和差别显示的精髓，并充分发挥了PCR反应以指数形式扩增双键模板而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段。现已被广泛地应用于分离编码产与未知的发育基因。,Neurospheres(NS)are cultured by the usual methods.Sister cultures are differentiated for 24 hours and each are subjected to representational difference analysis(RDA)with two rounds of subtraction.The subtracted products are then cloned into plasmids,propagated in bacteria,and arrayed at high density onto a glass slide.The custom microarray is then screened with amplified complementary DNA derived from a different set of neurosphere and differentiating cell(DC)cultures.The genes that are verified to be enriched in neurosphere cultures are then subjected to sequence analysis and further screening by in situ hybridization.Cy3 and Cy5 are green and red fluorescent dyes,respectively.bFGF,basic fibroblast growth factor;E17,embryonic day 17;P0,day of birth;P1 ctx,postnatal day 1 cortex.,三、根据DNA的插入作用分离目的基因,当一段特定的DNA序列，插入到植物基因组中目的基因的内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体植株。如果此段DNA插人序列是已知的，那么它便可用来作为DNA杂交的分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因。而后再利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法(DNA-tagging)。,DNA标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法，T-DNA（T-DNA tagging）和转座子（transposon tagging）均可作为基因标签。,转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。,异源转位子标签法(hetrologous transposon tagging)利用已经在分子水平上研究得比较清楚的外源转位子，分离异源基因的技术,同源转位子标签法(homologous transposon tagging)：用内源转位子分离同源寄主基因的技术,1.转座子标签法（Transposon tagging）,（1）采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标生物体；（2）转座子在目标生物体内的初步定位；（3）转座子插入突变的鉴定及分离；（4）转座子在目标生物体内的活动性能检测；（5）对转座子插入引起的突变体，利用转座子序列作探针，分离克隆目的基因。,转座子标签法的主要步骤：,(2)其次，转位子转位插入突变的频率比较低，而且在植物基因组中还常常存在着过多拷贝的转位子序列。因此，应用转位子标签法分离植物基因，不仅实验周期长，工作量大，同时还需花费大量的人力和财力。,转位子标签法的局限性：,(1)首先，转位子标签法只适用于存在着内源活性转位子的植物种类。而在自然界中这样的植物并不多。,(3)再者，如果转位子的转位插入作用引起了致死突变，或是对于由多基因控制的某种性状，转位插入造成的单基因突变就不足以使植株产生出明显的表型变异，就难以分离到我们所期望的目的基因的。,Transposon tagging,expression and sequence of the ra1 gene,a,DNA gel blot showing co-segregation of ra1-m2 and Spm.Lanes 15,Spm probe;lanes 610,same blot probed with DNA flanking the Spm transposon that co-segregated with ra1-m2.Phenotypes and genotypes of lanes:1 and 6,normal homozygous progenitor ra1+;lanes 2 and 7,mutant homozygous ra1-R;lanes 3,4,8 and 9,somatic mosaic of mutant and normal heterozygous ra1-R/ra1-m2;lanes 5 and 10,normal,heterozygous ra1-R/ra1-m2rev4(a stable,normal allele derived from ra1-m2).The 5.5-kb fragment(arrowheads)contains both Spm and ra1.The 7.8-kb progenitor ra1+fragment is restored by Spm excision,either in variable stoichiometries when excision occurs somatically(lanes 8 and 9)or entirely when it occurs germinally(lane 10).The 14-kb fragment(lanes 710)derives from ra1-R.b,RNA gel blot.Lane 1,vegetative shoot apices;lanes 26,equally staged immature tassels.c,Single letter amino-acid code translation of the ra1 open reading frame.Solid line indicates the zinc-finger,dotted line highlights the EAR domain.Changes in mutant alleles are shown above the sequence,adjacent to the allele designation:insertion locations indicated by carets;ra1-RS alternative methionine codon indicated with an arrow;amino acid changes shown.d,Multiple amino acid sequence alignment of the zinc-finger and EAR domains of RA1 from maize(RA1maize),sorghum(S_bicolor_2)and Miscanthus(M_sinensis),and of EPFs from maize,rice(AAAA.)and Arabidopsis(gi.).Absolutely conserved residues highlighted in red,highly conserved residues in yellow.,转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于T-DNA（transferred DNA）整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。,Systems for insertional mutagenesis in Arabidopsis,萘乙酰胺(Naphthalene acetamide,NAM),IAAH：吲哚乙酰胺水解酶基因(对萘乙酰胺NAM 敏感)；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因(对卡那霉素敏感),2.T-DNA标签法,花椰菜花叶病毒(CaMV)35S多聚增强子,在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefactyns)中，存在着一种决定植物产生冠瘿病的Ti质粒。这种质粒的T-DNA能够发生高频的转移。当根瘤土壤杆菌感染了寄主植物细胞之后，T-DNA通过其两端的25bp的同向重复序列，完全整合到植物的核基因组上。根据目前的实验结果，一般认为T-DNA在植物核基因组中的插入位置是随机的。在T-DNA标签法中，可通过在T-DNA序列中插入一个报告基因或是一个增强子，以有利于对转化的原生质体或是培养的细胞进行筛选。,T-DNA,Reverse genetics:Top,gene structure of FASCIATA 1 with exons in blue and introns in yellow.Red denotes a bacterial T-DNA that has inserted into the gene.Bottom,mutants lacking the wild-type FAS1 gene have altered development.,第二节 植物基因工程研究常用的基因,一、选择标记（selectable marker genes）,如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。克隆的外源目的基因，对于植物受体细胞的转化频率往往是相当低的。在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源的DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞，则更加稀少。为了有效地选择出这些真正的转化子，就有必要使用特异性的选择标记基因(标记基因)。科学家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。,植物细胞转化实验中，应选择何种选择标记基因：1)其代谢产物不干扰寄主细胞的正常的新陈代谢活动；2)为转化细胞提供抵抗选择剂抑制作用的能力；3)选择培养基中所用的抗代谢物对转化细胞再生植株的生长，不应有明显的影响。,主要是一类编码可使抗菌素(诸如新霉素、潮霉素、链霉素以及庆大霉素等)或除草剂失活的蛋白酶的基因。,植物基因工程研究常用的标记基因,1.新霉素磷酸转移酶基因,2.Bar基因,例：,卡那霉素是由卡那霉素链霉菌(Streptomyces hanamyceticu)产生的一种氨基糖苷类抗菌素，新霉素是弗氏链霉菌(Streptompce fradiae)产生的另一种氨基糖苷类抗菌素。这种抗菌素抗菌作用的机理是，通过与30S核糖体亚基的结合作用，而抑制蛋白质的合成。将neo基因转移到真核细胞中表达，同样能够使卡那霉素、新霉素以及G418失活。因此，获得了neo基因的转基因寄主植物细胞便具备了抵抗这些抗菌素作用的能力。该基因已被广泛地用作植物细胞转化的选择标记基因。不过有许多单子叶植物培养细胞，天然具有抵抗高水平卡那霉素的能力，因此在选用neo作选择标记基因时，这一点是要认真汲取的。,1.新霉素磷酸转移酶基因（NeomycinPhosphotransferase,NPT-）,卡那霉素抗性(Kanr)基因即新霉素磷酸转移酶基因(NPT)，亦可称为氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph 2)，它来自大肠杆菌(E.coli)的aphA2 基因。是目前在植物基因转化中应用最广泛的选择标记基因。它编码的产物氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3)酶)能对氨基糖苷类抗生素卡那霉素具有抗性。此酶最早是从细菌转座子Tn5 中分离得到的，它的作用原理是：NPT 基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生素失效，从而解除毒性。因为卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡。而转基因植物由于含有卡那霉素抗性(NPT)基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素，转化体就很容易从非转化体中筛选出来。,从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中克隆的bar基因，是一种十分有用的、尤其是对于禾谷类粮食作物特别有效的选择标记基因。它编码的膦丝菌素乙酸转移酶，通过乙酸化作用会使膦丝菌素失去毒性。表达bar基因的植物转化细胞，在经受致死剂量的膦丝菌素处理之后，仍能正常生长或是以接近正常的速率生长，而敏感的非转化植株则迅速停止生长，并在1021天内死亡。这个选择标记基因，已成功地应用于水稻、玉米、小麦、高粱以及大麦、燕麦、黑麦等多种禾谷类粮食作物的转基因研究。当然，在使用除草剂抗性基因bar作为选择标记基因时。要特别小心，以避免产生抗除草剂的转基因杂草。,2.Bar基因,A:Transgenic rice(Bar Gene)B:None-transgenic RiceTransgenic herbicide-resistant（抗除草剂）rice,These DNA cassettes were inserted into plasmid pJR1 with the bar gene under the control of the 35S promoter for selection of transformants on bialophos.EiStua1 and EiRtua1,sensitive and resistant-tubulin genes;Zmtub1,-tubullin gene;nos,nopaline synthase gene;term,terminus.,二、报告基因（reporter gene）,1.概念：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。一种理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。,2.报告基因的应用：启动子的检测、反式作用因子的检测、相关蛋白质的分离、基因工程细胞系的构建。,3.常用的报告基因,报告基因实质上起到了判断目的基因是否表达的标记基因的作用，故报告基因有时也可叫做选择标记基因(selectable marker gene)。目前研究工作者已经从大量的基因中挑选出了若干种有用的报告基因。,在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(npt)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。,nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。npt、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。,目前常用的一种报告基因是-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。,例：GUS(-glucuronidase)、大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶、萤光素酶基因、GFP,-葡萄糖醛酸糖苷酶(-glucurondase，GUS),大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶(-glucurondase，GUS)，具有良好的稳定性，灵敏度高，易于检测。作用的底物是无色的X-葡萄糖苷酸(X-glucuronide简称Xgluc，是Xgal的类似物)。当把表达-葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物细胞，同5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoly-D-glucuronide)一道温育时，GUS酶就会把反应体系中的此种无色的底物水解产生出深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝。GUS酶的此种显色水解作用，依所用的X-gluc底物的不同而有所差别。,大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶-(glucuronidase)GUS,转基因烟草的幼苗，在CaMV-35S 启动子作用下表达GUS(beta-glucuronidase)，不同的底物颜色不同：,转基因烟草,promoter trap vector with promoterless gus gene,pCAMBIA1301,pBS-RSP1/2,35S,Hyg(R),T3 P,Gus,RSP2,LacZ,NcoI,pCAM-Gus,Bam HI,Hind III,KpnI,Bam HI,KpnI,Hyg(R),T7 P,Gus,RSP1,KpnI,BamHI,Gus,Nos3,pCAM-RSP1/2-Gus,Hyg(R),35S,35S,35S,RSP2,RSP1,KpnI,用KpnI和BamHI双酶切后连接,BamHI,Nos3,Nos3,LB,RB,(1715 bp),First intron(1182 bp),LB,LB,RB,RB,水稻蔗糖合酶基因启动子驱动Gus基因的表达载体构建,萤光素酶基因,使用-葡萄糖醛酸糖苷酶的编码基因gusA作报告基因有一个明显的缺点，即组织化学检测法会使细胞致死。若是改用萤光素酶的编码基因(luc)则可避免细胞致死，而且表达目的基因的活细胞的分布状况还可根据萤光的产生被测定出来。因此，被广泛地用作植物基因工程研究的报告基因。最常用的是来自萤火虫(Photinus pyralis)的萤光素酶(luciferase)。这是一种分子量为60.7kD的单体蛋白质多肽，共有550个氨基酸，它的编码基因luc已经被克隆。,Luc Reporter Gene System,Photinus pyralis,萤光素酶基因（luciferase）,promoter trap vector with promoterless firefly luciferase gene,GFP(Green Fluorescent Protein),绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。,被烟草花叶病毒感染的烟草，通过GFP可观测病毒的侵染。,检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。,植物基因工程研究常用的报告基因,三、抗虫基因,1.微生物源的抗虫基因；2.植物源的抗虫基因；3.动物源的抗虫基因。,虫害是造成农作物减产的最重要的自然灾害之一，全世界每年粮食总产量因病虫害而减产的幅度约为37，其中仅虫害一项就占13，经济损失达数千亿美元(转引自L.Jouanin，1998)。目前农作物的虫害防治，仍然是主要依靠化学农药(agrochemicals)的使用。但它同时也存在着诸多方面的弊端，直接地影响到农业生产的进一步发展。植物基因工程的建立，特别是转基因技术的应用，为农业害虫的防治提供了一条全新的途径。,微生物源的抗虫基因,cry基因：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)最早于1902年在日本国发现，1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidal crystalline inclusions)，其中的晶体蛋白质(crystalline protein，Cry)是由叫做-内毒素(endotoxins)的原毒素亚基(protoxin subunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌株都会产生一系列的-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，故这种蛋白质又叫做杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)，或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bt toxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或-外毒素(-exotoxin)，同样也具有抑制幼虫生长的能力。,Cry基因,转双抗虫基因741杨 优良白杨杂种741杨表达载体上构建了两种不同杀虫机制的Bt CryIAc基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因（API）。并获得了一批对多种鳞翅目害虫具有高抗虫性的株系。国内第一批应用于商品化生产的转基因树木品种。,植物源的抗虫基因,1）蛋白酶抑制剂基因：在昆虫的体内存在着一些特殊的蛋白酶；常见的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸类蛋白酶。这些蛋白酶是昆虫生理代谢过程中的必要成分，负责裂解和消化食物中的蛋白质。一旦昆虫体内的这些蛋白酶的活性受到抑制，就将无法消化食物中的蛋白质成分，致使饥饿而死亡。有一些植物在长期的进化过程中，产生出了一种用以抵抗害虫侵染的天然的免疫体系，在这类植物细胞中含有相当丰富的蛋白酶抑制剂(proteinaes inhibitor，PI)，它可使昆虫体内相应的蛋白酶丧失活性。植物的蛋白酶抑制剂，是一类小分子量的蛋白质(525kD)，共有10个家族。根据它们作用的靶酶，又可分成四种不同的类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂(aspartyl protease inhibitor)。若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫特性。,植物蛋白酶抑制剂家族及类型,（1）S=丝氨酸蛋白质酶抑制剂；M=金属蛋白酶抑制剂；C=半胱氨酸蛋白酶抑制剂；A=天冬氨酸蛋白质抑制剂。（2）Bowman-Birk系指发现这种蛋白酶抑制剂的两位科学家的姓氏。,若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫的特性,半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cysteine proteinase inhibitor,Predicted three dimensional structure of oryzacystatin-I.Oc-(light blue)is positioned above the active site of papain木瓜蛋白酶(dark blue with the active cysteine shown in yellow)to show how the two molecules may interact,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(oryzacystatin-),可以抑制木瓜蛋白酶的活性，其mRNA在水稻开花两周时表达量最高，到种子成熟时则下降到了难以检测的程度。,Picture of tomato hairy roots,Effect of hairy roots expressing a cystatin on the growth of Globodera pallida.Red growth curve describes those animals collected from transgenic plants expressing the cystatin,the blue growth curve describes animals collected from wild type plants.Pictures show representative animals collected from the two sets of plants.The density of animals,their growth,development and fecundity were all affected.,-淀粉酶抑制剂基因,淀粉酶抑制剂基因-淀物酶抑制剂(-amylase inhibitor，-AI)最初定名为凝集素类蛋白质(lectin-like plotein)，它在高等植物，尤其是禾谷类作物和豆科作物的种子中，存量相当丰富。它们能够同一些昆虫肠道中的淀粉酶形成复合物，从而抑制淀粉酶的活性，因此-淀粉酶抑制剂刘在植物防卫昆虫侵害方面起着重要的作用。-淀粉酶抑制剂、植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)以表壳蛋白(arcelin，ARL)，三者组成了一种植物防卫蛋白质(plant defence proteins)家族。,-淀粉酶抑制剂（-amylase inhibitor）AI,-淀粉酶抑制剂与哺乳动物或鞘翅目昆虫肠道中的结合-淀粉酶形成复合物的方式，抑制淀粉酶的活性。,植物防卫蛋白质（plant defence proteins）:,植物凝集素（phytohemagglutinin,PHA）通过同哺乳动物或昆虫的肠道粘膜上的糖蛋白结合，发挥毒性,表壳蛋白(arcelin,ARL)有待于作进一步阐明，可能具有毒性，可能难以消化,烟草花叶病毒（tobacco mosia virus）TMV,凝集素基因,高等植物的许多组织，特别是种子和贮藏器官中，含有丰富的凝集素(lectins)，这是一类结合碳水化合物的蛋白质(carbohydrate-binding proteins)。事实已经证明，凝集素对于哺乳动物和鸟类是有毒性的，同时也已经观察到(Homoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)的昆虫均有毒害作用。然而有关其确切的作用机理，目前尚不清楚。,其它植物来源的抗虫基因,几丁质酶的确会干扰昆虫的消化作用。几丁质酶的编码基因已经克隆，并被导入到其它植物。例如，在转基因的马铃薯植株中芽豆几丁质酶的表达，虽然对于鳞翅目昆虫番茄蛾的生长与发育并无有害的影响，但却使茄无网蚜虫的生殖力(fecundity)明显地下降。烟草阴离子过氧化物酶(anionic peroxidase)的编码基因，当其被转移到不同种的烟草、番茄以及胶皮糖香树(sweet gun)中超量表达时，会对许多种鳞翅目昆虫、鞘翅目昆虫，以及紫色马铃薯蚜虫产生高水平的抗性。,动物源的抗虫基因,主要集中于哺乳动物的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和烟草天蛾的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。,动物源抗虫基因及其在转基因植物中的表达,四、抗病基因,1)抗病毒基因病毒交叉保护作用:早在 1929年H.H.Mckinney就已经观察到，感染了某种温和病毒株(mild virus strain)的植物，能够抵抗同种或相关的烈性病毒株(severe virus strain)的感染。这种现象叫做交叉保护作用(cross protection)，它在许多病毒中普遍存在。近年来，在表达正链RNA病毒外壳蛋白基因的转基因植株中，也观察到了类似的保护作用。病毒外壳蛋白是交叉保护作用的关键因子两种病毒外壳蛋白质接近，交叉保护作用的效果就越强烈。据此科学工作者设想，将编码外壳蛋白的基因克隆出来，并导入到敏感的植株进行表达，应有可能使之获得抵抗相关烈性病毒株侵染的能力。后来的实验证明了这一观点的可行性。,(2)抗细菌基因抗细菌的蛋白质(antibacterial proteins)是许多动物，包括节肢动物(尤其是昆虫)、两栖动物以及哺乳动物，抵抗病原微生物侵害的防卫机理的重要成分。这类蛋白质对众多的格兰氏阴性细菌及格兰氏阳性细菌，均具有灭活作用。其编码基因已经克隆、并已在转基因植株中表达的抗细菌蛋白质，有昆虫的裂解肽(lytic peptides)和溶菌酶(lysozymes)两大类。,(3)抗真菌基因现已发现在自然界中有许多植物、动物和微生物，都能够产生出抗真菌的蛋白质。现在有一部分抗真菌蛋白质的编码基因已经被克隆，并被转化到有关的植物当中，获得了抗性的表达。常见的有：几丁质酶基因和葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因、防卫蛋白基因、硫蛋白素。,转a21基因抗白叶枯病水稻,4)植物抗病的分子机理植物的防卫反应感染植物的病原微生物有病毒、细菌和真菌三大类。植物体本身具有抵抗病原微生物的两种防卫系统：被动的防卫系统是植物对付广谱病原微生物侵染的机械防御体系比如在细胞外壁上形成角质、蜡质、栓质以及木质素等附属结构物。而主动防卫体系，则是植物体针对特异性病原微生物侵染的一种特殊的防卫反应。目前已从多种植物病原微生物中，分离到了可激活植物发生防卫反应的激活子(elicitor)。它可通过与存在于植物细胞表面的受体蛋白质之间的结合作用，而激活植物发生防卫反应，包括过敏性反应(hypersensitive response，HR)和系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)两种类型。与此相对应，病原微生物还存在一种抑制子，它可能通过干扰激活子与受体蛋白质之间的结合作用、信号传导通路、基因表达的启动以及某些防卫蛋白质的活性等多种途径，来抑制植物的防卫系统，从而完成病原微生物的致病作用。,植物抗病基因与病原体无毒基因 早在1941年，H.H.Flor等人提出了描述植物与病原体之间相互关系的“基因对基因”的假说(“gene-for-gene”hypothesis)。该假说认为，毒性病原体的无毒祖先菌株，携带有一种专门对具有相应R基因的寄主植株无毒害作用的无毒基因(avirulence gene，Avr)；对病原体抗性(或不相容性)的植株必定存在着一种 R基因，而在病原体中也必定存在着一种与之相应的Avr基因；这两种基因中的任何一种的缺失或功能的丧失，寄主植株与病原体之间就不能发生相互作用，抗病反应就不会被激活，结果导致寄主植株染病(或与病原体相容)。在“基因对基因”假说的基础上，人们又提出了一种描述 R基因功能的激发子-受体模型(elicitor/receptor model)。根据这个模型，R基因编码的受体蛋白质，通过与病原体Avr基因编码的配体蛋白质之间的相互作用，使寄主植物能识别感染的病原体。由此看来，R基因编码的蛋白质产物可能有两种不同的功能：其一是分子识别，其二是激发植株发生防卫反应。,五、非生物胁迫的抗性基因,(1)重金属抗性基因金属硫蛋白(metallothionein，MT)，是一类在生物界广泛分布的、小分子量的、富含半胱氨酸的金属结合蛋白质。由于这类蛋白质与重金属离子，诸如镉(Cd)、锌(Zn)、铜(Cu)、汞(Hg)、金(Au)、银(Ag)、钴(Co)、镍(Ni)等，具有高度稳定的结合能力。到目前为止，已经分离了100多种金属硫蛋白基因。,(2)抗盐基因 人们发现在盐胁迫条件下生长的植物细胞中，会累积许多种低分子量的渗透调节剂，诸如甜菜碱(betaine)、脯氨酸(proline)以及糖醇(sugar alcohols)类物质包括甘露醇(mannitol)和山梨醇(sorbitol)等，从而使植物获得抵抗盐胁迫的能力。目前，以提高渗透调节剂合成水平为目标的植物耐盐基因工程已经开展，并已取得了若干有意义的实验结果。,betaine,(3)抗低温胁迫基因在自然界中，因低温(cold temperature)胁迫对农作物造成的冷害(cold injury)，包括寒害(chilling injury)和冻害(freezing injury)两个方面，两者之间是有着明确的界限的。一般说来，寒害是指0以上的低温对农作物生长造成的伤害，而冻害则是指0以下的低温对农作物的生长造成的伤害，主要是植物体内结冰，导致细胞受伤，甚至死亡。农作物的抗寒性状，往往是受多基因控制的，这些基因的表达特性可分为诱导型的和组成型的两大类。农作物在0以上低温的环境下经过一段时间的抗寒锻炼或低温适应性生长之后，就会被诱导合成出许多与抗寒性状有关的蛋白质，我们特称此类蛋白质的编码基因为冷诱导基因(cold inducible gene)或冷调节基因(cold regulated gene)。目前研究较多的是，甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase)基因。,农作物的抗冻性(freezing tolerance)是同抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)的作用密切相关的。抗冻蛋白质是一类能够抑制体液中冰晶生长的特殊的蛋白质，它可以使水溶液的冰点下降，但对熔点的影响却十分微弱，这就造成了水溶液的冰点和熔点之间出现差值。我们称这种差值为热