动物细胞工程制药的研究进展.doc

动物细胞工程制药的研究进展1161001413167 刘星星摘 要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。关键词：动物细胞工程；生物制药；细胞融合；转基因动物；细胞培养目录一、引言3二、动物细胞工程简介3（一）生产用动物细胞31.原代细胞32.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)43.工程细胞系44.转化细胞系4（二） 动物细胞工程制药技术51.细胞融合52.转基因动物53.细胞核移植技术64.动物细胞大规模培养7三、发展前景8四、结论8参考文献9一、引言动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。二、动物细胞工程简介所谓动物细胞工程，是根据细胞生物学及工程学原理，定向改变动物细胞内的遗传物质从而获得新型生物或特种细胞产品的一门技术。这一技术在生物制药的研究和应用中起关键作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80% ，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。当前动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面。本文就动物细胞工程制药所采用的细胞种类及相关技术等进行综述。 （一）生产用动物细胞 目前用于生物制药的动物细胞有4类，即原代细胞、二倍体细胞系、融合的或重组的工程细胞系和转化细胞系。 1.原代细胞原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等，Ender 最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗。原代细胞增殖能力有限，需要大量动物才能增加产量，费钱费力，限制了它的应用。2.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株称为 CCL。许多 CCL 建立于 50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。但 C C L 在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许 C C L 用于生产。7 0 年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性, WI-38 是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养 5 0 代，且无致瘤性，现在C C L 已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。表 1 列出了一些常用的生产用动物细胞系。3.工程细胞系 工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。用于构建工程细胞的动物细胞有 BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞系1-2。SP2/0 - A g 1 4 工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系 P 3 X 6 3 A g 8 融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体2。目前用重组 D N A 技术改造的 C H O 细胞生产干扰素、白介素、E P O 、单克隆抗体、诊断试剂以及其它各种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的热销产品，但这些产品的生产规模普遍较小(大多为 550 升的小型培养罐)5。4.转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。李红艳等研究空间环境对 CHO(dhfr )细胞生长特性的影响，结果表明空间诱变致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白的产量，为筛选优化的生物工程制药细胞提供可能3。目前 cHo(dhfr )作为重要的基因表达受体细胞，已成功应用于表达促红细胞生成素(EPO) 、重组乙型肝炎疫苗等生物制药领域4-5。 （二） 动物细胞工程制药技术1.细胞融合 细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法5。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等7-9。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退9-11。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退10，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。2.转基因动物 利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河13-14。 据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产 1 抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血红蛋白及人凝血因子、和抗凝血酶、血纤维蛋白原、t P A 等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2006 年 6 月，由美国 Genzyme 转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药 物 棗 重 组 人 抗 凝 血 酶 （ 商 品 名 ：ATryn 牋）已经获准上市12。 我国自 1998 年在国家“863 ”计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来，也取得了一些较好的成绩。1996 年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO 的转基因羊；1 998 年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛; 2 0 0 0 年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有人 a l 一抗胰蛋白酶基因的转基因羊1131；2005 年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到3.4 克 / 升和 1.5 克 / 升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白15-16。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。3.细胞核移植技术 细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。1998 年，Rohl 等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出 3只健康、同类的携带外源标记基因的转基因克隆17。Schnieke 等18用此法成功克隆出 3 只携带有人凝血因子 X 基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育，获得这 3 只绵羊，这 3 只绵羊能高水平地表达人凝血因子 X （125 g/ml ）。Cibelli等19同样也获得3头转基因牛。这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性，为细胞工程制药带来了光明前景。4.动物细胞大规模培养动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的 D N A 融合再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品，可采用此法。目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、回转生物反应器等。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术20-21。美国 Genentech 公司使用 CHO 细胞以 12,000L 搅拌式生物反应器培养槽生产 t - P A 重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。美国 G i b c o 公司建立的流加悬浮培养 rCHO 表达 r Gal 系统，采用化学修饰的无蛋白 C H O 细胞培养基并增加 T C A 循环，生物反应器中活细胞密度最高可达 107cell/ml。国内第四军医大学采用5L CelliGen 反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第 9 天细胞密度达到8 × 106cells/ml 以上22。目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道，同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器设计或设计新型的生物反应器。三、发展前景根据我国动物细胞工程制药的现状，今后应该将重点放在以下方面：1.建立动物细胞大规模培养的技术平台。该技术是转基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键技术，主要由以下几个要素构成： 2.高效的真核细胞表达系统。中国仓鼠卵巢细胞( C H O ) 作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象，是生物制药最为理想的表达系统，但也存在一些问题，如表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂。我们应从工程细胞本身着手，对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力； 3.性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、无血清培养基； 4.先进的生物反应设备；5.减少污染风险、提高产品质量和安全性；6.实行“动物药厂”计划，尽快实现转基因动物乳腺生物反应器的产业化；7.发展下游工程，主要是转基因表达产物及产品的分离纯化，在提高产品的纯度和产量同时，降低成本。四、结论总之，我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，与欧美国家相比还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。随着生命科学的发展和细胞工程技术研究的深入，将会有更多的细胞工程药物出现，具有广阔的应用前景。 参考文献：1姜倩倩,刘京贞,苏瑞强.单克隆抗体药物进展.药物生物技术,2005,12(4):270-274.2李志勇细胞工程M.北京科学出版社,2003:3-21.3李红艳,徐梅,向青,等.空间诱变致生长减慢 CHO(dhfr 一)细胞株的特性.中国康复理论与实践.2004,10(11):647-648.4赵玮,戴长柏,孙茂盛.红细胞生成素（E P O ）在中国仓鼠卵巢细胞（C H O ）中稳定表达.云南大学学报.1999,21(3):175-178.5孟宗达,韩秀兰,林惠芳,.我国研制的乙型肝炎基因重组（C H O ）疫苗对乙型肝炎病毒母婴传播阻断效果观察.中国计划免疫.2001,7(2):94-95.6Kohler G, Milstein C. Continuouscultures of fused cells secreting anti-body of predefined specificityJ.Nature,1975,256(5517):495-497.7李刚,刘鹏,刘诚迅,等。我国细胞工程制药的研究现状和发展前景. 中国现代 应用药学杂志,2002,19(4):278-281.8霍乃蕊,韩克光.细胞融合技术的发展及应用.激光生物学报,2006,15(2)：209-213.9张京航，贺武. 抗人结肠癌杂交瘤细胞系的建立及单克隆抗体特性研究.细胞与分子免疫学杂志.1997,13(2):25.10Avigan D, Vasir B, Gong J, et al.Fusion Cell Vaccination of Patientswith Metastatic Breast and Renal CancerInduces Immunological and ClinicalResponses.Clin Cancer ResJ.2004,10(14):4699-4708.11康玉,徐丛剑.肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗的临床应用. 国际免疫学杂志 2006,29(4):225-229.1213沈子龙,廖建民等.转基因动物技术与转基因动物制药J. 中国药科大学学报,2002,33(2)81-86.14Brink MF, Bishop MD, Pieper FR.Developing efficient strategies for thegeneration of transgenic cattle whichproduce biopharmaceuticals in milkJ.Theriogenology.2000,53(1):139-14215Zakhartchenko V,Sehernthaner W,Prelle K,et a1Nuclear transfer inthe bovine embryo: developmental po-tential of cultured adult cellsJTheriogenology.1999, 51: 21816邱志芳,章孝荣,陶勇.转基因动物在生物制药工业中的应用. 生物技术通讯,2005,16(2):213-221.17郭黠,谢辉,何承伟.转基因动物研究进展.医学综述.2006,l2(5):268-270.18Schnieke AS,Kind AJ,Ritchie WA,et a1Human factor 9 transgenic sheepproduced by transfer of nuclei，fromtransfectedfetalfibroblastsJ.Science,1997,278:2130- 2133.19 Cibeli JB,Stice S L,Golueke P,et a1Cloned transgenic calvesproduced fromnonquiscent fetal fibroblastsJScience,1998,280：1256-125820王佃亮, 韩梅胜.动物细胞培养用生物反应器及相关技术. 中国生物工程杂志. 2003,23(11):24-27.21Hui Zhu,Shang-Tian Yang.Long-term continuous production of mono-clonal antibody by hybridoma cellsimmobilized in a fibrous-bedbioreactorJ. Cytotechnology 2004,44:1-14.22米力，陈志南.动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择. 中国生物工程杂志.2003,23(7):1-6.