胚胎移植技术在山羊良种生产中的研究与应用.doc

胚胎移植技术在山羊良种生产中的研究与应用 洪琼花 金卫华 袁跃云 等摘要家畜胚胎移植技术是家畜繁殖领域的一项高新生物技术。本研究通过对不同品种、季节、年龄和重复超排对山羊超排反应的影响，胚龄和移植方法对移植产羔率的影响及不同孕激素制剂对同期发情效果的影响等因素进行分析，为山羊胚胎移植产业化提供理论和技术依据。本研究于2000年9月2005年6月分别对883只（次）波尔山羊、95只黑山羊、78只努比山羊和31只萨能奶山羊采用孕激素+FSH法进行超排处理，结果表明：努比山羊的超排反应好于其它三个品种，其次是波尔山羊、萨能奶山羊和黑山羊，波尔山羊与努比山羊，黑山羊与萨能奶山羊在回收胚胎数、受精卵数、可用胚数间差异不显著（P>0.05），而波尔山羊、努比山羊与黑山羊、萨能奶山羊在以上三者间差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）；超排具有重复性，第二次超排回收胚数显著高于第一次（P<0.01），分别为15.21±6.54枚、13.09±7.39枚，且可用胚数也高于第一次，但两次间差异不显著（P>0.05）；经产羊超排后只均回收胚胎数明显高于育成羊（P<0.01），分别为15.97±6.77枚、12.08±5.42枚，而可用胚数育成羊和经产羊间差异不显著(P>0.05)，可用胚率育成羊高于经产羊，分别为6.01%和81.15%，但差异也不显著（P>0.05）；对12080只受体黑山羊埋置CIDR或孕酮海绵栓并分别注射Folligon的方法进行同期发情处理，24h内的同期发情率差异极显著（P<0.01），分别为93.87%和71.22%。32h内的同期发情率分别为97.35%和95.37%，差异不显著(P>0.05)，说明使用CIDR+Folligon对山羊进行同期发情，发情较集中；萨能奶山羊的胚胎移植产羔率高于波尔羊、黑山羊和努比山羊，分别为54.86、52.16、50.59和52.93，但差异不显著（P>0.05）。囊胚的移植产羔率显著高于桑椹胚和孵化囊胚的移植产羔率（P<0.01），而桑椹胚、扩张囊胚和孵化囊胚的移植产羔率间差异不显著（P>0.05）；手术法和腹腔镜法胚胎移植的产羔率分别为52.66和52.19，两种方法移植产羔率差异不显著（P>0.05）；在云南，春秋两季对波尔山羊超排效果无显著差异（P>0.05）。关键词山羊胚胎移植超数排卵同期发情山羊业是畜牧业生产的重要组成部分，优良羊种的选育、扩繁是迅速提高养羊经济效益的主要途径。云南省草山草坡、山羊资源丰富，存栏数量多(2004年存栏近800万只)，具有发展山羊生产得天独厚的自然条件。建国以来，羊种改良和选育是云南省发展养羊业提高质量的主要技术措施。近几年，先后引进了努比山羊、波尔山羊、萨能奶山羊对地方品种山羊进行改良，对云南省山羊业的发展起到了巨大的推动作用。家畜胚胎移植技术是家畜繁殖领域的一项高新生物技术，可充分利用具有优秀遗传性状及生产性能的品种或个体，或利用从国外引进的珍稀品种及育种核心群，迅速扩大其后代数量。山羊胚胎移植的成功依赖于一套完善、成熟的技术体系，是一项严密的系统工程。只有把好每一个技术环节，才能降低各种变化因素对胚胎移植效率的影响，本研究通过对不同品种、季节、年龄和重复超排对山羊超排反应的影响，不同胚龄、不同移植方法对移植产羔率的影响及不同孕激素制剂对同期发情效果的影响等因素进行分析，为山羊胚胎移植产业化提供理论和技术依据，从而提高胚胎移植技术在山羊良种扩繁和育种中的应用效率。1材料和方法1.1时间和地点2000年9月2005年6月，在云南省7个种羊场对883只次波尔山羊、95只黑山羊、78只努比山羊和31只萨能奶山羊进行超排处理，对12080只受体黑山羊采用不同的孕酮制剂实施同期发情处理的结果进行了观察。1.2供体母羊的选择及饲养管理供体母羊为1998年从澳大利亚引进及自繁的纯种波尔山羊、云南地方良种黑山羊、努比山羊、萨能奶山羊，年龄为1-4岁，健康、无繁殖疾病。供体母羊除正常的饲养管理外，在超排处理前一个月加强补饲富含维生素、蛋白质、矿物质的配合饲料。1.3受体羊的准备及饲养管理受体羊为云南地方良种黑山羊，年龄25岁，经产、健康、繁殖机能正常。购入后用氯前列烯醇进行流产处理，并加强补饲和管理，使其尽快适应新的环境和饲养管理，膘情达到中等以上。1.4药品垂体促卵泡素（oFSH,Ovagen）：新西兰ImmunoChemicalProductsLtd.生产；Folligon和Progestin：澳大利亚IntervetPty.Ltd.生产；CIDR：新西兰Pharmacia&UpjohnPty.Ltd.生产，0.3g/支；孕酮海绵栓：澳大利亚IntervetPty.Ltd.生产，每个含孕酮40mg；氯前列烯醇（I.C.I80996）：上海市计划生育科学研究所生产。1.5供体羊超数排卵采用孕激素+FSH法进行超排处理，即在供体羊发情周期的任意一天阴道埋置第一个CIDR（第1d），第10d换第二个CIDR，第16d开始连续4d等量注射oFSH（2次/d），经产羊的总剂量为7.04mg/只、育成羊的为5.28mg/只，第7次注射oFSH时，取出CIDR，并准确记录取栓时间；取栓后第二天发情，发情后开始第1次配种，之后间隔12h进行第2、3次配种。在发情后第4d注射Progestin（2次/d）。1.6受体羊的同期发情处理采用埋置CIDR或孕酮海绵栓和注射Folligon对受体羊进行同期发情处理。在受体羊发情周期的任意一天埋置CIDR或孕酮海绵栓（与供体羊同步进行），撤栓时每只羊注射Folligon200IU。1.7胚胎的采集及移植超排羊自发情后第7d用手术法从子宫中冲取致密桑椹胚或囊胚，用于鲜胚移植或冷冻保存。采用常规手术法和腹腔镜法进行胚胎移植，供、受体羊发情同步差在±12h的可进行移植。移植部位除与供体羊采胚部位相对应外，还应选择有黄体且黄体发育良好侧的子宫角移植。1.8统计分析采用t检验。2结果与讨论2.1不同品种山羊超数排卵效果比较表1不同品种山羊超排结果比较品种供体羊数回收胚胎数受精卵数未受精卵数平均获可用胚数波尔山羊88314.37±6.58a14.21±7.13a0.16±3.2012.16±6.49a黑山羊958.83±3.88b8.40±3.84b0.43±2.057.54±4.77b努比山羊7817.26±7.22a16.67±6.43a0.59±1.7614.97±6.35a萨能奶山羊3112.73±6.91b11.25±5.94b0.87±2.7110.12±4.79b注：同一栏数值中具有不同字母上标示差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）从表1可看出，四个品种山羊通过回收胚胎数、受精卵数、可用胚数的比较，表明努比山羊的超排反应好于其它三个品种，其次是波尔山羊、萨能奶山羊和黑山羊，经t检验分析，波尔山羊与努比山羊、黑山羊与萨能奶山羊在回收胚胎数、受精卵数、可用胚数间差异不显著（P>0.05），而波尔山羊、努比山羊与黑山羊、萨能奶山羊在以上三者间差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01），由此说明，不同品种山羊使用同一激素剂量所获得的超排反应、可用胚数不同，说明遗传因素对超排反应影响较大，繁殖力高的山羊其超排后回收胚数和可用胚数亦多。从不同品种超排结果的标准差可看出，超排反应在个体间也存在较大差异，这可能与处理羊对外源激素不敏感或缺少对FSH敏感的卵泡有关。在实验过程中还发现，排卵数较多的山羊个体存在排卵不同步的现象，从而导致胚胎的发育阶段不一致，降低了胚胎的质量，这可能与超排激素制剂中FSH和LH的比例有关。2.2重复超排对波尔山羊超排效果的影响表2.重复超排对波尔山羊超排效果的影响超排次数供体羊数回收胚胎数受精数未受精数平均获可用胚数第一次23713.09±7.39b12.67±6.450.51±3.4311.13±6.42a第二次23715.21±6.54a14.48±7.160.78±5.9412.97±7.31a注：同一栏数值中具有不同字母上标示差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）分别对237只波尔山羊进行重复超排处理，即于第一次超排后使供体羊自然繁殖一胎，然后进行第二次超排。两次超排所用的oFSH剂量和超排方法相同。从表2可看出，第二次超排回收胚数明显高于第一次超排（P<0.01），两次超排的可用胚数差异不显著（P>0.05），但第二次超排的可用胚数高于第一次，且采胚过程中发现，由于第一次手术较成功，第二次回收胚胎时，子宫很少发生粘连。由此表明，在超排后，让母羊自然繁殖一胎，超排反应和胚胎回收率不受重复超排的影响。另外，在实际生产中应注意选择超排效果较好的母羊进行重复超排，以提高胚胎移植的效率，也更能加速遗传改良进程，这对山羊MOET育种的实施极为有利；重复超排的总体成功率不仅取决于排卵数量的多少，且取决于以后几次重复采胚的胚胎回收率，所以应尽量安排采胚技术熟练的技术人员进行手术操作，以提高对母羊的重复利用率和超排效率。2.3育成和经产波尔山羊超排效果比较表3.育成和经产波尔山羊超排效果比较组别供体羊数回收胚胎数平均获可用胚数可用胚%育成羊18512.08±5.42a10.39±5.67a86.01a经产羊37915.97±6.77b12.96±6.85a81.15a注：同一栏数值中具有不同字母上标示差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）用经产羊3/4剂量的oFSH、相同的超排方案对育成羊进行超排，从表3可看出，经产羊超排后每只平均回收胚胎数明显高于育成羊（P<0.01），可用胚数育成羊和经产羊间差异不显著(P>0.05)，虽然育成羊的可用胚率高于经产羊，分别为86.01和81.15，但平均可用胚数经产羊高于育成羊2.57枚。说明在生产实际中应尽量选择经产母羊做供体。2.4受体黑山羊同期发情效果同期发情是山羊胚胎移植计划中的一项重要技术。本实验分别用CIDR+Folligon和孕酮海绵栓+Folligon对本地黑山羊进行同期发情处理，表4表明，受体羊在24h内和2432h内同期发情率差异极显著（P<0.01），但32h内的同期发情率差异不显著(P>0.05)，说明使用CIDR+Folligon对山羊进行同期发情，发情较集中，提高了发情的同期性和胚胎移植的效率。这可能与孕激素的载体不同有关，CIDR是用硅胶作为载体，能保证孕酮的量与释放速度，而用海绵栓做载体，孕酮在操作过程中易损失，且释放的量在不同时间应该有差异。表4.用CIDR和孕酮海绵栓对受体羊同期发情的效果比较方法处理羊数24h内发情率（）24-32h内发情率（）同期发情率（）CIDR+Folligon814593.87a3.48a97.35a海绵栓+Folligon393571.22b24.15b95.37a注：同一栏数值中具有不同字母上标示差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）2.5不同供体山羊胚胎移植产羔结果比较从表5可看出，来自于三个山羊品种的胚胎移植后，产羔率差异不显著（P0.05），萨能奶山羊的胚胎移植产羔率高于其它三个品种，分别为54.86、50.59、52.16和52.93。表5.不同品种山羊胚胎移植产羔结果比较胚源胚胎数移植受体数产羔数产羔数/胚胎数(%)黑山羊71671136250.59a波尔山羊100239892522852.16a努比山羊72976740652.93a萨能奶山羊39422612454.86a注：同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）2.6不同胚龄对胚胎移植产羔率的影响不同发育阶段的胚胎在受体羊发情后第7d移植。从表6可看出，囊胚的移植产羔率高于桑椹胚、扩张囊胚和孵化囊胚，经t检验分析，囊胚的移植产羔率显著高于桑椹胚和孵化囊胚的移植产羔率（P<0.01），而桑椹胚与扩张囊胚和孵化囊胚的移植产羔率间、扩张囊胚与囊胚的移植产羔率间差异不显著（P>0.05）。表6.不同胚龄对胚胎移植产羔率的影响 胚期胚胎数移植受体数产羔数产羔数/胚胎数(%)桑椹胚35033718653.14a 囊胚29728518461.95b 扩张囊胚1551398756.13ab 孵化囊胚47422451.06a 注：同一栏数值中具有不同字母上标示差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）2.7不同胚胎移植方法对移植产羔率的影响表7.不同胚胎移植方法对移植产羔率的影响移植方法胚胎数移植受体数羔数产羔数/胚胎数()手术法82198211432852.66a腹腔镜法37523377176252.19a注：同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）表7所示，通过手术法和腹腔镜移植法对胚胎移植产羔率的影响比较，两种方法移植产羔率分别为52.66和52.19，经t检验分析，移植产羔率差异不显著（P>0.05），腹腔镜法略低于手术法，但腹腔镜法节省了移植的时间，减少了对受体的损伤，从而提高了受体的利用率。2.8季节对波尔山羊超排效果的影响表8.季节对波尔山羊超排效果的影响季节供体羊数回收胚胎数平均获可用胚数春季33913.74±7.15a11.65±6.42a秋季54414.77±6.23a12.49±5.81a注：同一栏数值中具有相同字母上标示差异不显著（P>0.05）山羊是季节性的繁殖动物，且繁殖旺季出现在秋季；季节对山羊的超排反应是有影响的，尽管用孕酮处理可消除季节对超排反应的影响，但大量的试验证明，仍以繁殖季节的超排反应较好。但在本试验中，从表8可看出，春、秋两季波尔山羊超排效果差异不显著（P>0.05），这是由于云南独特的气候环境和饲养条件所致。3结论山羊胚胎移植的成功依赖于一套完善、成熟的技术体系，是一项严密的系统工程。山羊多采用以孕酮类阴道栓同期发情为基础的超数排卵方案，在山羊超排方法中以FSH孕激素法超排效果较稳定。在实施山羊胚胎移植计划时，只有在综合考虑了以上影响因素的情况下，才能有比较满意的移植产羔结果，也才能在良种生产中规模化应用，促进山羊良种化进程。参考文献（略）