[Northern Blot]合成探针方法.docx

Northern Blot合成探针方法合成DNA探针步骤： 1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序或者直接把胶回收产物取一部分送测以检验序列是否准确。 2. 20l体系 10 ng至3 g DNA，加双蒸水至15l，盖紧用蜡封好。 沸水浴10分钟以使DNA变性，迅速置于冰中。 Note: Complete denaturation is essential for efficient labeling. 3 加入以下试剂： Hexanucleotide Mix, 10 × (vial 5) 2 l dNTP Labeling Mix (vial 6) 2 l Klenow enzyme labeling grade (vial 7) 1 l 混匀，短暂离心。 37° C孵育1 h 到20 h (overnight)，一般为16-18小时 4加入 2 l 0.2 M EDTA (pH 8.0) 或于65° C 加热10 min以终止反应。 Note: The length of the DIG-labeled fragments range from 200 to 1000 bp. 合成RNA探针步骤： 过程应保证无RNA酶的环境。 1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序，需向公司说明测序结果要带上SP6、T7的序列，RNA探针是单链的，选择使用哪个启动子至关重要。假如northern blot的对象是单链RNA，合成的RNA探针序列就必须与它互补。呼肠孤病毒基因组为双链RNA，因此不需要考虑这个问题。 2. 提纯质粒，酶切以进行线性化 3. 转录： 在冰上加入以下试剂： 1 g 线性化的质粒DNA x l DIG RNA labeling mix, 10 × 2 l Transcription buffer, 10 × 2 l 加无RNA酶的水至总体积为 18 l RNA polymerase (SP6, T7 or T3) 20 U/l 2 l 混匀，短暂离心。 37° C孵育2 h. 4. 消化DNA 加2 l RNase-free DNase I 37° C孵育15 min Note: Only required for RNase-protection experiments! 5. 加 2 l 0.2 M EDTA (pH 8.0)终止反应。 6. 纯化，见说明书。