OMEGA总RNA提取试剂盒说明书BBH.docx

OMEGA总RNA提取试剂盒说明书BBHE.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps) 步骤 A真核细胞和组织 自备材料： 巯基乙醇、70乙醇、除RNase的枪头和EP管、disposable latex gloves。 细胞的步骤 1 在microfuge tube中用TRK裂解缓冲液裂解细胞，使细胞团松散，轻弹EP管或者用枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的巯基乙醇。 如果是单层的组织培养细胞，可以直接在细胞培养器里裂解细胞。吸净培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加600ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中，更小的培养器则加350ul的TRK。Pipette buffer over entire surface of vessel 以使裂解完全。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至干净的1.5mlEP管中，然后进行第2步。 如果细胞是悬液培养，收集细胞*5min，弃上清，加入TRK）裂解液，漩涡振荡混匀。 2 匀浆化裂解产物 “裂解和匀浆化样品”第四页有更详细的说明，如果细胞1*105，漩涡振荡1min。样品匀浆化不完全会显著的减少RNA的产量并容易造成柱子堵塞。 a) 用匀浆器30 s，使样品匀浆化，而后进行第3步。 b) 使裂解产物通过钝的针头的注射器，使之匀浆化。注射器要除RNase。进行第3步。 c) 将裂解物转移入omega homogenizer spin column,10000g离心1分钟。将flow-though移入新的tube中，进行第3步。 组织的步骤： 1 TRK裂解缓冲液在microfuge tube中裂解细胞，使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的巯基乙醇。 350ulTRK裂解液最多能有效裂解20mg组织。对20mg以上组织用600ul的TRK裂解液。然而，不要超过30mg组织，这是推荐的最大量。 对组织样品，匀浆化参照第四页，选择一种方法使用，除非是使用液氮，在TRK液/beta巯基乙醇中匀浆样品而后进行step2。 2 离心，>1,4000*g, 5min, 室温。将上清液移入一新的1.5ml管中，而后进行第3步。 总RNA分离： 3 向裂解产物中加入等体积的70%乙醇，mix thoughly by pipeting。 4 Apply样品到Hibind RNA Mini column上。the spin cartridge的最大容量为750ul。A precipitate may form on addition of ethanol in step 3。加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。With the spin column inside a 2ml collection tube, 室温离心，10,000*g,0.5-1min。弃去流出液而后进行第五步。 5 将柱子放在一个新的2ml收集管中，加上300ul RNA wash buffer I。室温离心，10,000*g, 0.5-1min。同样弃掉流出液。在第6步中重新使用收集管。如果要on-membrane DNase I消化，进行第6步，否则进行第7步。 6 DNase I 消化。 7 将柱子再放到同一个2ml收集管中，加入500ul RNA wash buffer I, 室温离心，10,000*g, 3060s，弃流出液。 8 将柱子放到一个新的2ml收集管中，加入500ul RNA wash buffer II，室温离心，10,000*g, 3060s，弃流出液。在第9步中重新使用这个收集管。 9 用500ul RNA wash buffer II洗涤一次柱子，同上一步骤一样。室温离心，10,000*g, 30-60s，弃流出液。然后使收集管空着，20,000*g, 2min, 室温离心，使的HiBind 基质完全干燥。 10 洗脱RNA。转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中，加入3050ul的DEPC水洗脱柱子。确保水直接加到了柱子的基质上。10,000*, 1min, 室温。如果RNA的总量大于30ug，可以进行二次洗脱。 注意：可以选择性地，可能会用更多的水洗脱RNA。如果进行二次洗脱，总RNA的量会增加，但是浓度会降低，因为80以上的RNA会在第一次时被回收。离心前将水加热到70并室温孵育柱子5min会增加产量。