微生物标本正确采集与临床课件.ppt

微生物标本的正确采集及与临床相关问题的解读,平顺县人民医院检验科 马晓丽,主要内容,我院常见微生物标本的正确采集微生物与临床有关问题的解读,微生物标本规范化采集的重要性,正确采集、处理与运送细菌培养的标本直接关系到致病菌培养的正确性与阳性率的高低，是临床细菌检验成功的关键。标本质量的好坏直接影响诊断结果的正误，不当的标本可导致假阴性、假阳性结果的出现，因此标本采集与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础。好的微生物检验标本可提升实验室工作效率及病患照顾质量，降低医疗成本。,标本采集的一般原则,一、早期采集 采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型 时，并且必须在使用抗菌药物之前采集。如果已 经使用抗菌药物，采集应在停药一周后进行，如 不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。,2023/3/9,二、无菌采集 采集的标本应无外源性污染。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、腹水、关 节液等无菌液时，应注意对局部及周围皮肤 的消毒，严格进行无菌操作.对于与外界相通的腔道注意正常菌群的污染.,2023/3/9,样本收集、运送及保存过程中，须避免他人被感染。于送检申请单上提供足够的有关临床资料。如：尿 培养如果已经使用过抗菌药物应在化验单上批注，当菌落计数105 达不到感染指标时我们会考虑病人 已使用过抗生素的影响因素。即刻将样本送达实验室，不可拖延。,2023/3/9,最有价值的细菌学检测标本,血液培养 脑脊液培养 胆汁培养 胸腹水培养 关节液 其他无菌体液或分泌液,2023/3/9,血培养采集的标准,2023/3/9,血培养的指征,1）发热（38）或(36)；2）寒战；3）白细胞计数增多（计数10.0109/L,特别有“核左移”时）或减少（计数3.0109/L）；4）皮肤黏膜出血；5）昏迷；6）多器官衰竭；7）血压降低；8）C反应蛋白升高；可疑感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：9）突然发生的急性呼吸、体温和生命体征改变；,2023/3/9,采集血培养样本的最佳时间,尽可能在患者寒战或发热高峰前后采血在患者接受抗生素治疗前采血如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次 用药之前采血培养,2023/3/9,为什么不是病人高热时采血？,根据人体免疫系统对于感染的反应特点来看，一般是先有感染，后有抗感染反应，人体对于感染的强烈反应就是通过细菌的代谢产物或其产生的毒素刺激人体体温调节中枢引起发热的。发热后人体各种免疫因子将最大程度地被调动起来，各种酶促反应在一定程度内大大加快。当感染因（各种病毒、细菌、真菌等）被暂时控制住后，体温会逐渐降下来。,2023/3/9,关于血培养套数与采血部位,应同时采集2-3套血培养，2天-5天内无需重复采集。只有在怀疑感染性心内膜炎或其它血管内感染时，才有必要间隔多次采集血培养。,2023/3/9,成人“一套”血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各 一个，也叫“一份”注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套 应从另一个穿刺点获得。儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集 多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,2023/3/9,关于采集血液量,采血量是影响灵敏度最关键因素成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶8 10ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90以 上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染。,2023/3/9,采各种血液标本的先后顺序,血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。所以要最先采集血培养标本。,2023/3/9,采血步骤,采集血培养标本之前首先做好手卫生。静脉穿刺点选定后，去除血培养瓶的塑料瓶帽，切勿打开金属封口环和胶塞，使用75%酒精消毒，自然干燥60s。1、穿刺点皮肤消毒程序：严格按以下三步法进行：(1)75%酒精擦拭静脉穿刺部位待干30s以上。(2)用一根碘伏棉签消毒皮肤60s，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上。(3)75酒精脱碘。对碘过敏的病人只能用75%酒精消毒，消毒60s。待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。,2023/3/9,2、培养瓶消毒程序 在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。3、培养瓶接种程序 抽取血液后，不要换针头，直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒混匀，以防血液凝固。如果同时作需氧和厌氧培养，应先将标本接种到厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。,2023/3/9,血培养系统适用的其它标本,腹膜透析液腹水胸水关节液羊水其它无菌的体液,2023/3/9,下呼吸道（痰）标本的采集,2023/3/9,病原体种类繁多而复杂使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫,2023/3/9,咳痰途经口咽部不可避免地受到污染,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108 109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。我国痰细菌培养的阳性率为30%左右。,2023/3/9,我国痰细菌培养现状,临床上约半数咳痰标本不合格！苛养菌检出率极低结果重复性差感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距,2023/3/9,痰标本的正确采集,自然咳痰法：晨痰为佳，用无菌生理盐水漱口数次（为减少口腔正常菌群污染标本），深咳呼吸道深部痰（非后鼻部分泌物、非唾液）留于无菌容器内。诱导痰：对于痰量少或无痰的患者先用湿牙刷刷口腔粘膜、舌头和牙龈，勿用牙膏，采用雾化吸453NaCI水溶液20-30ml，用无菌杯收集诱导痰标本。支气管镜采集法：,2023/3/9,痰培养的运送和保存,所有病人的下呼吸道标本应在采集后立即送至微生物室，不能大于2小时。室温下放置1h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率而定植于上呼吸道的非致病菌则会过度生长。,2023/3/9,痰标本报告单的解读,涂片结果：合格标本：WBC25,上皮细胞25或10-25 对于合格的标本并结合病人的临床症状参考 药敏结果用药。,2023/3/9,有关痰标本的一些问题,采集痰标本前使用抗生素将降低致病菌的检出率。一些常规培养不生长的菌可能是引起感染的致病菌。实验室报告的细菌培养阳性结果，很多情况难以排出细菌定植与污染。,2023/3/9,念珠菌痰培养阳性应否给予抗真菌药物治疗,目前对于痰培养发现念珠菌要不要给予治 疗的问题仍然存在争议。临床留取的痰标本是否合格是影响检验结 果的关键因素。不合格的标本培养出念珠 菌，可能为真菌定植或污染，对临床诊断 意义不大。,2023/3/9,采用支气管镜留取下呼吸道标本可以减少污染，尽管这种方法难以被普遍采用，但留取标本的可 靠性高，对临床真菌感染的诊断有较大的指导意 义。对存在真菌感染高危因素的病人，两次以上痰培 养出念珠菌，同时有真菌感染的临床症状应给予 抗真菌治疗。,2023/3/9,痰或呼吸道分泌物非发酵菌定植或感染的思考,无人工气道,无感染表现：非发酵菌等多种病原体考虑污染或定植有感染表现肠杆菌科同时有非发酵菌先治疗肠杆菌科有感染表现：纯肠杆菌科或非发酵菌 针对性治疗,有人工气道,无感染表现：非发酵菌（哪怕3+4+）定植（可考虑换管）肠杆菌科（+）定植可能大（3+4+）针对性治疗有感染表现：肠杆菌科同时有非发酵菌 考虑全覆盖有感染表现：纯肠杆菌科或非发酵菌 针对性治疗,2023/3/9,泌尿标本采集的规范,2023/3/9,尿液培养标本送检指征,有典型的尿路感染症状；肉眼脓尿或血尿；尿常规检查表现为白细胞和/或亚硝酸盐阳性；不明原因的发热，无其他局部症状；留置导尿管的病人出现发热；膀胱排空功能受损；泌尿系统疾病手术前。,2023/3/9,尿培养样本采集方法,清洁中段尿标本:晨尿为佳，嘱咐患者睡前少饮水，保证与上次排 尿时间间隔4小时以上。女性采样前用肥皂水清洗会阴部，女性应分开大阴唇，男性应上翻包皮，仔细清洗，再用清水冲洗尿道口周围。将前段的尿液丢弃，留取中段尿液约10ml直接排入无菌杯中，立即送检。于一小时内接种。该方法简单、易行，是最常用的尿培养标本收集方法.,2023/3/9,留置导尿管收集尿液：利用留置导尿管采集标本时，应先消毒导尿管外部，按无菌操作方法用注射器抽取导尿管中的尿液，操作时应防止混入消毒剂，不能从收集袋中采集尿液。长期留置导尿患者，应在更换新尿管时留取尿标本。,2023/3/9,留取尿液标本应注意的事项,正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问 题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄 球菌等存在。而这些细菌又是尿路感染中常见的 病源菌。因此要作好尿液细菌学检查，首先应注 意标本收集问题。尿液经尿道排出时会受到尿道内正常菌群的污染,但定量培养时计数不会超过103 CFU/m l,泌尿 系感染时定量培养计数在104 105 CFU/m l。,2023/3/9,另外,由于绝大多数的泌尿系感染是由肠杆菌科细 菌引起,而此类细菌的硝酸盐还原实验为阳性,故 可参考尿常规检查中的硝酸盐还原实验来推断是 否有细菌感染。多数药物从尿道排泄,所以标本采集应力争在未使 用抗生素之前或停用抗菌药5d之后留取尿液标本;如果已使用了抗生素，要在化验单上标注。尿液在膀胱内应停留6 8h以上，使细菌有足够 的时间繁殖,故应尽量采集早晨第一次的尿,同时注 意避免消毒剂污染标本。,2023/3/9,尿标本化验单的解读,1、对于G-杆菌菌落计数 105cfu/ml，G+菌菌落计数 104cfu/ml，符合泌尿感染要求.2、对已使用过抗生素的病人应在化验单上注明。我们会根据细菌的生长情况作药敏试验以供临床参考。3、若生长三种菌则考虑污染的标本。,2023/3/9,穿刺液类标本的采集,2023/3/9,穿刺液培养标本包括胸水、腹水、心 包液、关节液、鞘膜液等穿刺液培养 标本。(穿刺液比引流液更有价值）采集时间：一般在用抗生素等抗菌药 物治疗之前，或在停止使用抗菌药物 之后2 3d采集标本。,2023/3/9,采集方法：无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本。标本采集量应1ml。标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检。如果能采集到10ML的标本量，可将抽取液直接注入血培养瓶进行培养，阳性率会有所提高。,2023/3/9,分泌物采集规范,2023/3/9,尽可能在用药之前采集标本。对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁 桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘 管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的 分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部或边缘的标本 分泌物，也可取感染部位下的组织送检。,2023/3/9,闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺 或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意 脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。,2023/3/9,分泌物、穿刺液、化验单的解读,1、生长三种细菌考虑污染。在采集标本时，应注意无菌操作，以防带入与感 染无关的皮肤定植菌。2、经常出现无菌生长的原因 标本中的脓细胞可能是白细胞吞噬掉细菌后中毒 而死亡的尸体。细菌被白细胞吞噬后，白细胞及 死亡后的尸体释放出某些抑菌物质抑制了细菌的 进一步繁殖。,2023/3/9,3、患者体内残余抗生素抑制了细菌的生长 4、深部脓液内本来是厌氧菌生长，用常规有 氧条件培养，细菌不会生长。,2023/3/9,临床对细菌室可能的抱怨,理由 报告发出时间太慢；阳性率太低，临床符合率差；结论：细菌室水平太差，还是凭经验用药！,临床对细菌室可能的抱怨报告发出时间太慢,分析原因：细菌生长慢，生长需要适宜的条件。细菌一般以二分裂法进行无性繁殖，在适宜条件下，多数细菌分裂一次需要20-30分钟，结核分枝杆菌需18-20小时才分裂一次。对数期（鉴定、药敏常用该期的培养物）一般在培养后8-18小时。普通细菌培养一般需48小时（培养需12-24小时，鉴定药敏需要12-24小时）；酵母样真菌阳性报告需要2-3天，阴性报告需5天；丝状真菌（霉菌）阴性报告需2-4周；血培养阳性报告需3天以上，阴性报告需5-7天。解决方法:分级报告；急诊报告；非培养方法,临床对细菌室可能的抱怨阳性率太低，临床符合率差,分析原因：标本采集、送检不规范，这是关键原因！不合格的标本直接导致病原菌分离率降低。操作程序不规范，未进行直接涂片，未严格执行拒收制度等也是重要原因。微生物和人体关系复杂。致病和条件致病，定植和感染等，导致细菌室判断病原菌困难，要证明培养结果与感染相关性是临床微生物检验所面临的难题。已使用抗菌药，病原菌受到伤害，不能正常生长。实验室条件有限，苛养菌漏检，常规培养不能检测厌氧菌、结核杆菌、衣原体、支原体、病毒等.解决方法：拒收制度；规范操作；改进技术；加强沟通,阴性报告结果的解读,阴性报告提示以下可能非感染性疾病感染已治愈感染未治愈，但各种原因导致病原体未检测出来采样运送不当:标本采集、送检、保存不当，导致病原菌死亡，污染菌大量增殖；抗生素影响：经抗菌治疗，标本中含大量抗生素，病原菌受到伤害，不能正常生长；苛养菌：如嗜血杆菌、军团菌、淋球菌等因培养基营养成份不佳或培养条件限制，导致漏检；特殊病原体：常规培养无法检测的病原体如厌氧菌、结核杆菌、衣原体、支原体、病毒等。检验技术受限:实验室条件和人员技术影响。,痰培养阳性结果分析,常见有三种情况第一种情况：患者有典型的呼吸道感染症状，按细菌报告选抗生素疗效明显这类患者的痰标本共同特征：痰涂片革兰染色:见大量的白细胞，并见白细胞吞噬或伴行大量形态一致的非上呼吸道正常菌；痰培养：生长大量非上呼吸道正常菌，痰培养与痰涂片所见一致结论：报告的细菌为病原菌。,痰培养阳性结果分析,第二种情况：患者有典型的呼吸道感染症状，按细菌报告选用的抗生素治疗无效，改为凭经验联合用药这类患者痰细菌检验时有如下特征：痰涂片：大量白细胞，吞噬或伴行的是革兰阳性球菌（形似葡萄球菌）、革兰染色阴阳不定的小球菌或杆菌（形似厌氧菌）、出芽的念珠菌，偶见革兰阴性杆菌；痰培养：生长大量阴性杆菌，痰涂片所见的大量细菌不生长或少量生长，痰涂片镜检与痰培养结果不一致。结论：报告的细菌为定植菌,痰培养阳性结果分析,第三种情况：患者的感染已基本治愈，做痰检的目的是希望得到一张阴性报告作为停止治疗、出院的凭证这类患者的痰做细菌检验时的特征：痰涂片：显示标本来自上呼吸道,大量上皮细胞,大量阴性杆菌，少量白细胞。痰培养：生长大量阴性杆菌，较常见的是绿脓杆菌和不动杆菌结论：报告的细菌为定植菌。,尿培养阳性结果的解读,正常情况下的尿液是无菌的，但膀胱中的尿液经尿道排出体外时可受到下尿 道中正常菌群的污染而出现细菌。因此对不同方法获取的尿液标本培养结果需正确评价，才能有效指导临床合理治疗。尿培养应同时做菌落计数才有意义。一般认为，清洁中段尿标本中单种细菌菌落数105CFU/ml可能为感染；105CFU/ml，革兰阳性菌 104CFU/ml，念珠菌103cfu/ml为诊断尿路感染的标准。,尿培养阴性结果的解读,以下因素可使尿液中细菌数量减少，判断结果时应予以注意：使用抗生素治疗，细菌生长受到抑制；尿液稀释，尿比重 8.5，细菌生长受阻；尿频时，膀胱内细菌停留时间短，菌落数减少；尿道口消毒液混入标本中，影响细菌繁殖，菌落数减少；不同种类的细菌生长速度不同、营养要求不同，菌落计数有所不同。,相关问题如何正确应用药物敏感结果？,正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面：首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床；重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考；考虑到药敏试验的局限性：体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。原因：1.分离的细菌不是真正的致病菌。污染菌？定植菌?2.药敏标准的局限性，CLSI制定的药敏折点不能全面考虑到药物在体内的代谢，导致药敏标准有时和疗效标准不一致。3.体外药敏条件较单一而恒定，而体内环境比较复杂。根据药敏报告治疗可能存在90/60原则即药敏报告敏感的药物90%治疗有效，但报告耐药的仍有60%有效。解决方法：1.实验室应与临床密切配合确定真正的致病菌。2.根据药动学和药效学参数（PK/PD)制订给药方案。时间依赖型药物：%TMIC，浓度依赖型药物：Cmax/MIC和AUC/MIC。,药敏试验的有关问题,药敏试验的标准：我国药敏试验是参照美国的CLSI推荐的标准制定的。体外药敏试验选择药物的原则代表性：所选药物具有代表性及对同类药物有提示作用。预报性：选择合适的药物可对抗菌药物有提示作用。如：葡萄球菌耐苯唑西林提示对所有-内酰胺类抗生素耐药，革兰阳性菌耐庆大霉素提示对氨基糖苷类耐药；,2023/3/9,药敏试验的有关问题,肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶或氨曲南耐药，提示菌株可能产超广谱-内酰胺酶（ESBLs).特殊性：选择感染部位有效高浓度的抗菌药物。如：尿路感染选择呋喃妥因；中枢神经感染选择能通过血脑屏障的药物如头孢呋新等。,代表药物在药敏试验中的作用预报性,是否能将所用的药都做药敏试验?药敏的组合都是根据CLSI的首选标准制定。通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌 药物的敏感性。,2023/3/9,不是所用药物都可以做药敏试验（需要 药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）某些细菌对某类抗生素天然耐药，则不需要做 药敏试验。试验的药物代表一类药，而不是一种药。,2023/3/9,常见细菌的天然耐药情况,马越,李景云,金少鸿.细菌耐药性监测分析中应注意的问题.中国抗生素杂志,2005，30(12):763,为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报 告几种药物？报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少，只报告头孢他啶、左氧氟水星、米诺环素和复方磺胺甲唑（抗菌优）；而用于洋葱伯克霍德菌的抗菌药有4种：头孢他啶、美罗培南、米诺环素和复方磺胺甲唑（抗菌优）。,2023/3/9,革兰氏阳性杆菌、流感和卡它，为何药敏结果没有敏感提示？,药敏结果参照CLSI标准，目前革兰氏阳性杆菌没有参照标准，做药敏试验参照阳性球菌。,培养阳性的细菌都需要用抗菌药 物治疗吗？培养阳性感染，可能为污染（血培养），可能为定植（痰培养）任何结果必须结合临床情况进行评价（很重要）感染部位的清创、引流、换药比使用抗菌药物更加重要改善患者全身情况：器官功能支持，纠正酸碱平衡，电解质紊乱，低蛋白血症，高血糖等,2023/3/9,常见感染细菌的经验用药,细菌耐药概念,多重耐药（MDR）:指细菌同时对三种以上结构不同（作用机制不同）抗菌药物耐药，如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类；泛耐药（PDR）:细菌对本身敏感的所有药物耐药；超级细菌:并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，以下细菌属于此列：MRSA/VRSA;VRE;MDR-PA,PDR-AB;ESBL(+)+AmpC(+)肠杆菌产碳青霉烯酶肠杆菌（产KPC酶、包括产NDM-1细菌）,2023/3/9,谢谢！,2023/3/9,