380.B毒死蜱降的微生物降解及中间产物分析 开题报告.doc

本科毕业设计(论文)开题报告题目：毒死蜱的微生物降解及中间产物分析课 题 类 型 科研 论文 模拟 实践 学 生 姓 名： 学 号： 专 业 班 级： 生物工程学 院： 生物与化学工程学院指 导 教 师： 开 题 时 间： 2010年3月 2010年3月20日一. 毕业论文内容及其研究意义毒死蜱是一种广谱性有机磷杀虫剂，是目前世界上杀虫剂中销售额最大的品种，是陶氏化学公司于1965年在美国登记推广并获得专利。也是目前全球应用最广泛的五种杀虫剂之一。其被世界卫生组织分成卫生类和农用类两个类别，分别用来作卫生杀虫剂和农用杀虫剂。毒死蜱于1997年在我国取得了正式登记1。本论文实验主要利用微生物对毒死蜱的降解作用，研究某种毒死蜱降解菌株对毒死蜱的降解作用，研究该菌株对毒死蜱降解的降解过程和降解谱，并对其降解中间产物进行分析。本实验有利于深刻了解和研究毒死蜱降解菌株对毒死蜱的降解作用及其降解过程，有利于毒死蜱降解过程中产物的研究，对毒死蜱降解菌株降解毒死蜱的过程研究及目前毒死蜱污染问题的解决具有深刻的研究意义和实践意义。二. 毕业论文研究现状及其发展趋势2.1 毒死蜱的发展现状毒死蜱子1965年被美国陶氏化学公司首次开发以来，其作为以前高毒杀虫剂的替代品已经得到广泛的利用。毒死蜱对昆虫具有触杀、胃毒和一定的熏蒸作用, 是一种广谱高效的杀虫、杀螨剂。毒死蜱是一种神经毒剂, 能抑制乙酰胆碱酯酶的活性, 使神经突触部位大量乙酰胆碱积聚, 致使突触后膜不断激活, 神经纤维长期处于兴奋状态, 正常的神经传导受阻, 从而使昆虫中毒致死。毒死蜱在植株叶片上的残留期不长, 但在土壤中残留期较长2。2.1.1 毒死蜱的应用现状毒死蜱广泛用于防治蝼蛄、蛴螬、地老虎等地下害虫, 喷雾可防治棉花、果树、蔬菜、甘蔗、花卉等作物上的多种害虫及螨类等; 还可以防治蚊、蝇、跳蚤、蜚蠊等卫生害虫; 近年来在桑树上的应用逐渐增多, 已在美国、日本、加拿大、中国等10 多个国家和地区注册, 同时在非农业中也有所应用。毒死蜱是一种在麦类、水稻、玉米、棉花、甘蔗、果树等多种作物上普遍使用的高效广谱杀虫剂, 对防治小麦吸浆虫和地下害虫等都有较好效果。毒死蜱在我国目前是农药中的畅销品种, 用量相当大。毒死蜱原药分成卫生级和农用级两个级别，分别用来制作卫生杀虫剂和农用杀虫剂。在美国，毒死蜱及其系列产品是应用最普遍的卫生杀虫剂，每年大约有二千多万个家庭用来防治白蚁、虱子、跳蚤和蟑螂等，有效地保护了这些家庭的财产、孩子和宠物等免遭这些卫生害虫的侵害；作为农用杀虫剂，可有效防治水稻、苹果、柑桔、小麦、棉花、玉米、甘蔗、蔬菜等上的螟虫、卷叶虫、粘虫、介壳虫、蚜虫、螨类、菜青虫、小菜蛾、黄曲条跳甲、韭蛆等百余种害虫。1997年，陶氏益农生产的卫生杀虫剂蚁定清(有效成分为毒死蜱)在我国农业部农药检定所获得登记，用于室外的白蚁防治。在农用杀虫剂方面，毒死蜱的系列产品48%乐斯本乳油于1984年在我国农业部农药检定所取得登记，获准在水稻、棉花、苹果、柑桔、蔬菜等作物上使用防治稻纵卷叶螟、稻飞虱、棉铃虫、蚜虫、介壳虫、菜青虫等方面。同年，上海市政府在菜篮子工程建设中，推荐了乐斯本等几种农药在夏季高温时用来防治蔬菜害虫，以彻底取代甲胺磷等高毒农药。近年来，高毒农药的大量使用对环境造成的负面影响已引起我国政府的关注。在农药工业“十五”发展规划中，我国政府要求在此期间彻底削减高毒有机磷杀虫剂，毒死蜱是甲胺磷和对硫磷等高毒农药的高效、低毒替代品种。我国已有许多厂家生产毒死蜱，主要生产厂家有：山东华阳集团、河北沙隆达股份有限公司，湖南沅江化工厂，浙江新安江化工集团公司，浙江仙居农药厂，江苏南通染化厂，苏州化工集团公司，福建福州精细化工总厂，河北滏阳化工厂等。可以预见，毒死蜱有非常广阔的市场和应用前景。2.1.2 毒死蜱的残留毒性及污染现状 毒死蜱在叶片上的残留期因不同作物而异, 各种作物收获前停止用药的安全间隔期, 棉花21d, 水稻7d, 小麦10d, 甘蔗7d, 大豆14d, 花生21d, 玉米10d, 叶菜类7d3。Lee 等4研究了大米在煮前和煮后的毒死蜱含量, 结果表明, 煮前用水洗大米, 能够去除60%的毒死蜱;煮熟后, 大米中还残留占总药量30%的毒死蜱。OByme 等研究了不同的食品加工方法中毒死蜱的残留情况, 结果表明, 通过煮、烘烤和加工成罐头三种方法加工的食品,毒死蜱残留量为煮>加工成罐头>烘烤。Yen 等对三种土壤进行的实验结果表明, 土壤温度从25升到35,毒死蜱的半衰期分别从28、15、12d 降到2、3、7d。毒死蜱具有较高的急性毒性, 是农产品安全性问题重点关注的农药品种之一, 在对外贸易中是农药残留检测的主要项目5。关于毒死蜱的环境行为研究报道很多: 毒死蜱对人的神经系统和脑发育会有一定影响, 对儿童有潜在的健康危害; 毒死蜱的广泛应用对环境造成了严重的污染。目前以鼠为对象研究毒死蜱对人体的毒害作用也正成为人们研究的热点6; 美国环境保护局官员Browner 指出, 毒死蜱在土壤中的降解受土壤温度、湿度、毒死蜱的浓度、土质、微生物活动等影响较大。由于毒死蜱使用范围及用量的不断扩大, 毒死蜱在环境中的转归不容忽视。许多国家对农产品，特别是蔬菜上的毒死蜱残留量有严格的规定，例如日本，大米、麦类等粮食作物上最高残留限量为0.1 mg·kg-1，甘蓝和白菜为1 mg·kg-1，西红柿和甜菜为0.05 mg·kg-1，其它蔬菜上的最高残留限量一般为0.01 mg·kg-1。2002年2月，浙江省台州的蔬菜西兰花，在日本临时加严的检验中部分被检出农药残留超标，出口受阻；日本加严的农残检测项目包括甲胺磷、敌敌畏、毒死蜱、氰戊菊酯等。我国加入WTO，关税壁垒将逐渐削减，但是，贸易国日益增高的技术壁垒，尤其是“绿色壁垒”，对我国残留工作提出了更高的要求；如在蔬菜中毒死蜱残留量问题上，日方对进口的菠菜的限量标准是0.1mg·kg-1，而对本国生产的萝卜限量标准却高达3 mg·kg-1。毒死蜱农药，本身在叶片残留期并不长，但是，由于农民管理水平有限，加上贸易国严格的残留量要求，使其残留问题日益受到重视。如何解决这一问题已经提上日程 7。2.2 毒死蜱降解的发展现状2.2.1 光化学降解农药施用以后，无论是残留于植物表面还是进入土壤、水体或大气，均会因受到太阳辐射，而发生光化学降解。其实质是化合物接受光辐射能量后，光能转化到化合物分子键上，使农药中的C-C、C-H、等键断裂而发生内部反应的过程。毒死蜱在自然光下的半衰期约为34周，降解比较缓慢，但自然界中大量存在的腐殖质等光敏剂能显著加速其光解速率。另外，其他农药和表面活性剂也影响光解速率。岳永德等研究发现:毒死蜱在玻片表面的光解半衰期为42.62h,抗蚜威、丙烯菊酯对毒死蜱的光解有显著的加速光解作用；林丹、氟氯菊酯、杀螟松对毒死蜱有显著的延缓光解作用,6种表面活性剂中,2201、0201、JFC对毒死蜱的光解有显著的加速光解作用。虽然光解是农药在环境中消解的主要途径之一，但它受到光照的限制，一般只发生在表层水、土壤中，光解半衰期是34周。但是光降解在水深处或冬天里并不是理想的方法 8。2.2.2 水体中的降解虽然毒死蜱农药目前一般不会直接用于水体，但农药施用以后，一部分会通过径流、渗漏、冲刷等途径进入水体，严重威胁着水体的质量。另外，残留在土壤中的农药也因土壤中所含的水分而发生降解。在开放的水体中，毒死蜱的浓度和持久性主要根据剂型的不同而有所差异。例如，在施用于开放水体中时，乳剂和可湿性粉剂使水体中毒死蜱浓度趋于增加的现象。当农药被吸附到沉淀物上时，浓度又迅速下降。微粒剂和缓释剂则不会增加浓度，且持久性时间增长。毒死蜱进入淡水或海水中，主要是喷雾或者是土壤微粒携带进入。在水中，毒死蜱迅速被悬浮沉淀物和底部物质吸附。蒸发是毒死蜱减少主要的途径。蒸发半衰期是3.520d。研究还表明，这类杀虫剂在水体中是不稳定的。水解速率随温度升高而增大，每降温10，速率降低2.53倍。在酸性-中性水中，水解速率变化不大。但在碱性水中，速率呈增加趋势。另外，农药本身的浓度也影响其水解速率，60d内高浓度时水解速率明显小于低浓度时的水解速率。由此看出毒死蜱在环境中的水解速率除受所属环境条件的影响外,还受农药初始浓度的制约9。2.2.3 土壤的吸附。土壤颗粒能强烈吸附毒死蜱农药，不易水解。在土壤中，毒死蜱表现出了很强的稳定性。不易透过土壤层，污染地下水，在粘土和粘性砂土中不容易移动。土壤对毒死蜱的主要降解产物TCP吸附能力不强，毒死蜱在土壤中表现出适当的流动性和持久性。在氧气充足的土壤中，在结构上从砂土到粘土、pH值从5.47.4七种土壤条件中，毒死蜱的半衰期从11141d。毒死蜱在高pH值下不稳定，半衰期不受土壤结构、有机质浓度影响。在缺氧土壤中，在砂土中的半衰期为15d，粘土中的半衰期为58d。土壤中吸附的毒死蜱将被光解、化学水解、微生物降解等。在潮湿的土壤中，毒死蜱的有效半衰期为45163h。另有研究表明，在施药30d后，2.6%9.3%的毒死蜱分别残留在砂土和疏松的土壤中。毒死蜱在土壤中的半衰期一般为60120d，但根据土壤类型、气候和其他条件的不同，其半衰期可缩为2周或延续到1a以上10。2.2.4 毒死蜱的生物代谢降解（一）植物上的消解。有研究表明，植物可从土壤或水系统中富积毒死蜱。植物富积毒死蜱后具有毒性，如莴苣等。且这种杀虫剂及其在土壤中的代谢物可能会加速其自身在一些作物上的富积。目前人们已对作物上的毒死蜱降解状况作了不少研究，不过这些研究对象还主要集中在淡水作物上。通过实验发现毒死蜱在大棚青菜上的降解速度明显慢于在露地青菜上的降解；在研究毒死蜱在水稻上的消解实验中发现:毒死蜱能有效防治一些钻蛀性害虫是由于具有一定的渗透性能11。（二） 毒死蜱在人和动物体内的代谢降解。毒死蜱主要分布在动物肝脏、肾脏、脾脏等血流量高的器官。脱3，5，6-三氯和-2-吡啶基及葡萄糖苷化是主要的代谢途径。大多数以原形和代谢物经尿道排除，较少通过粪便排泄。毒死蜱无生物蓄积性，经皮吸收极少。经皮给药量是口给药量的10倍时，血液浓度也只有经口吸收的1/15。不同动物类型对毒死蜱的积累能力也不同。在研究海洋动物对农药的富积实验中发现，富积能力由大至小顺序：小弹涂鱼、实验贝类、褶痕相手蟹。不同动物对毒死蜱的降解能力各不相同，弹涂鱼的降解能力最强，毛蚶次之，波纹巴非蛤和文蛤的降解能力较差。在研究鲮鱼对毒死蜱的代谢时发现：鲮鱼能迅速富集水中的农药而达到最高值，随后浓度明显下降。各器官组织的峰值高低顺序为：内脏团>整体>鳍>眼>剩余部分>肌肉12。（三）微生物降解大量研究表明,利用微生物及其产生的降解酶对环境中农药残留的去除与净化是治理农药污染的有效方法,并已显示了良好的应用前景。从受农药污染严重的土壤或水体筛选、分离具有优良性状的菌种是目前采用最多的一种方法13。有关毒死蜱微生物降解的研究已经取得一定进展,筛选和分离出了一些降解毒死蜱的微生物。报道最早的毒死蜱降解微生物是从施用二嗪农和对硫磷的土壤中筛选出来的,它们通过共代谢作用降解毒死蜱,不能以毒死蜱为唯一碳源。有学者将前人找到的降解对硫磷等的黄杆菌(Flabobacterium sp.)和节杆菌(Arthrobacter sp.)用来降解毒死蜱,取得了良好的效果。此外还有很多降解菌的报道。国内对毒死蜱的微生物降解起步较晚,但发展比较迅速。杨丽从蔬菜大棚土壤中分离到一株能以毒死蜱为唯一碳源和能源生长的菌株DSP3,该菌在土壤实验中20d对毒死蜱(100mg/kg)的降解率接近100%14。Mallick等15分离到的降解对硫磷等的微生物Flabobacterium sp.Arthrobacter sp用来降解毒死蜱,取得了良好的效果。李晓慧从长期受毒死蜱污染的污水处理池中分离到一株毒死蜱高效降解菌株,该菌株能在24h内完全降解100 mg.L-1的毒死蜱。秦坤等筛选了三株真菌均能以乐斯本为唯一碳源生长从而将其降解,吴祥为等从毒死蜱废水处理系统出口处的污泥中筛选出三株毒死蜱高效降解菌。王金花等从污水排放口污泥中分离到三株以毒死蜱为唯一碳源生长的真菌WZ-、WZ-和WZ-,鉴定均为镰孢霉属(FusariumLK.exFx),三株菌5 d内对50 mg/L毒死蜱的降解率分别高达93.5%、91.4%和83.5% 16.Getzin LW17在4种土壤中进行的毒死蜱降解实验中,用14C标记毒死蜱,结果表明,毒死蜱经土壤微生物降解,初步降解产物为3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCP),最终降解产物为CO2。刘新等从连续使用毒死蜱的土壤中分离了1株可降解毒死蜱的真菌曲霉Y,该菌还对甲胺磷有较强的降解能力,对乐果有一定的降解能力18。3.微生物降解毒死蜱的应用前进和发展趋势农药污染的微生物降解近年来受到国内外专家学者的普遍关注, 报道不断增多。在我国, 环境问题已被提到了重要的议程, 首先在法律政策方面逐渐缩小和发达国家的差距。国家环保总局( SEPA) 从1998 年就开始致力于有关环境保护法律法规的制定, 针对环境污染制定污染预防和削减手册, 但是环境中污染物的浓度仍然很高。在技术层面, 我国的环境生物降解技术还处于刚刚起步阶段, 与发达国家还存在一定的差距。目前, 在其他污染物如石油污染的生物降解等领域的实际操作已取得突破性进展, 可作为农药污染生物降解的借鉴。分子生物学的发展, 农药降解菌酶固化技术的研究也为农药污染生物降解的实际应用提供了可能。三主要参考文献1 郑燕飞, 花日茂, 操海群; 毒死蜱微生物降解研究进展J; 安徽化工;2008,10:34(5).2 王焕民, 张子明. 新农药手册.北京: 中国农业出版社, 1989.3 安秋凤,李临生,陈孔常.氨乙基氨丙基硅油的制备、乳化及应用J.西北轻工业学院学报,2000,18(2):93-97.4 Angelo J Sabia.Modification of the Tactile and Physical Properties of Microfiber Fabric Blends with Silicone PolymersJ.Text.Chim.Color.,1995,27(9):79-81.5 张瑗霞,袁素兰,阮洪芬.氨基硅油中氨中和值及中间产物环氧值、含氯量的测定J.有机硅材料及应用,1995(5):23-25.6 Kacham R,Karanth S,Baireddy P,et a1.Interactive toxicity of chtorpyrifos and parathion in neonatal rats:Role of esterases inexposure sequence-dependent toxicityJ.Toxicol and Appl Pharmacol,2006,210:142-149.7 刘新，尤民生，魏英智，等降解毒死蜱曲霉Y的分离和降解效能测定J应用与环境生物学报，2003，9(1)：78808 岳永德,王如意,汤锋,刘坤.毒死蜱在土壤中的光催化降解.安徽农业大学学报,2002,29(1):13.9 吴慧明，魏方林，楼建晴，朱国念.毒死蜱的水解研究.宁波高等专科学校学报,2001,Vol.13(Sup):101104 .10S.P.Kale,F.P.Carvalho,K.Raghu,P.D.Sherhane,G.G.Pandit,A.MohanRao,P.K.Mukherjee and N.B.K.Murthy.Studies on degradation of 14C-chlorpyrifos in themarine environment.Chemosphere,vol.39(6):969-976. 11 黄炳球等毒死啤在水稻上的渗透消减研究，农药，Vol.39No.11 23-26.12 钟创光等.四种14C标记农药在某些海洋动物中的积累和降解.热带海洋V01.17.No.4 Oct.1998.13 刘玉焕,钟英长.真菌降解有机磷农药乐果的研究J.环境科学学报,2000,20(1):95-99.14 杨丽,赵宇华,张炳欣,张昕.一株毒死蜱降解细菌的分离鉴定及其在土壤降解中的应用J.微生物学报,2005,45(6):905-909.15 袁玉伟,王静,叶志华.菠菜对土壤中毒死蜱残留的吸收研究.生态环境,2007,16(4):1098-1102.16 王金花,朱鲁生,王军,秦坤.3株真菌对毒死蜱的降解特性J.应用与环境生物学报,2005,11(2):211-214.17 李界秋,黎晓峰,沈方科,张超兰.毒死蜱在土壤中的环境行为研究J.农业资源与环境科学,2007,23(1):168-171.18 刘新,尤民生,魏英智,等.降解毒死蜱曲霉Y的分离和降解效能测定J.应用与环境生物学报,2003,9(1):78-80.四毕业论文研究方案及工作计划据文献报道毒死蜱的降解产物，Me1kle等检测到了O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯和3，5，6-三氯-2-吡啶酚(TCP)两种产物。Custavo等检测到了0，O-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯，O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐助磷酸酯和TCP三种产物。Walia等检测到了0,O-二乙基-0-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯一种产物。申丽等检测到了0，0-二乙基-O-3，5，6-三氯-2-吡啶基)磷酸酯，0，0-二乙基-0-(5，6-二氯-2-毗陡基)硫代磷酸酯，0，O-二乙基-0-(5-氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，0，0-二乙基-O-2-吡啶基磷酸酯，和TCP五种产物。Jalal检测到了二乙基磷酸酯，三乙基磷酸酯，0，O，0-三乙基硫代磷酸酯，0，O-二乙基-0-甲基-硫代磷酸酯，二乙基-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯，2，3，5-三氯-6-0-乙基吡啶，2，3，5-三氯吡啶，和TCP七种产物。也有研究只检测到了TCP一种产物。4.1 实验药品与试剂磷酸二氢钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水氯化钙（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水硫酸镁（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司七水合硫酸亚铁（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司无水硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司牛肉浸膏（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司蛋白胨（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司丙酮（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司冰醋酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司甲醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司乙腈（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司硫酸铵（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸氢二钠（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸二氢钠（分析纯） 中国医药（集团）上海化学试剂公司琼脂毒死蜱标准品（100g/L）48%毒死蜱乳油88%TCP原粉（工业纯）实验室提供的毒死蜱降解菌株A4.2 实验仪器与设施TD5Z台式低速离心机 湖南凯达科科学仪器有限公司HH-2恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司BS-IEA振荡培养箱 國華電器DHG-9143BS-电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂气相色谱检测器 日本岛津质谱仪 日本岛津全塑防腐通风柜 南京航宇建筑配套工程有限公司无菌工作台冰箱 三菱公司pH精密试纸 上海三爱思试剂有限公司定性滤纸 杭州新华纸业有限公司0.22m水系膜细菌过滤器DR79045 20-200L移液枪 芬兰DRAGONMED500ml锥形瓶 酒精灯250ml锥形瓶 接种环烧杯 移液管玻璃棒 试管培养皿 漏斗针筒注射器 容量瓶BP211D电子天平 色谱柱4.3 实验方法步骤4.3.1 配制毒死蜱降解菌的培养基4.3.1.1 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g； 蛋白胨 10g；氯化钠 5g；琼脂 20g；蒸馏水 1000mL；pH 7.07.24.3.1.2 富集培养基牛肉膏 3g； 蛋白胨 5g；氯化钠 5g；蒸馏水 1000mL；pH 7.07.24.3.1.3 基础培养基（无机盐培养基）0.4g MgSO4·7H2O, 0.002gFeSO4·7H2O, 0.2gK2HPO4, 0.2g(NH4)2SO4, 0.08gCa SO4,蒸馏水 1000mL, pH 7.07.2(以上培养基均在121下高压蒸汽灭菌锅内灭菌30min)4.3.2 制备pH=7.2的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液72mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液+28mL 0.2mol/L NaH2PO4溶液4.3.3 制备毒死蜱降解菌菌悬液把菌种接菌于牛肉膏蛋白胨培养基上，活化3天后，将菌苔用接种环刮下，接种于富集培养液上，24h后，离心（5000r/min,15min），弃取上清液，收集菌体。然后将菌体用磷酸缓冲液洗涤3次，最后再用缓冲液制成菌悬母液。4.3.4 毒死蜱降解中间产物分析体系4.3.4.1 毒死蜱降解菌降解毒死蜱用移液枪吸取一定量的48%毒死蜱乳油至锥形瓶中，再加入10ml毒死蜱降解菌菌悬液，用无机培养基加至100ml，使毒死蜱的浓度为100/L。同时设置不加菌的对照试验。在30，120r/min条件下摇床培养。4.3.4.2 样品处理及降解毒死蜱的中间产物的检测 每隔24小时各取20ml培养液样品，分别向其中加入6g氯化钠，摇匀后10ml二氯甲烷，振荡萃取15分钟，静置分层后，收集下层二氯甲烷萃取液。萃取2次。将收集到的二氯甲烷萃取液经无水硫酸钠漏斗脱水后，用0.22m水系膜细菌过滤器过滤，进行气质联用色谱分析。4.3.4.3 气相色谱检测条件 DB-5 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 m），；柱温采用程序升温，初温120（保持1 min），以10/min 升温至160，以5/min 升至200，最后以10/min 升至250；检测器为FPD检测器，温度为150，进样口温度为240，采用不分流进样，分流比为30:1，载气为氦气，流速1.0mL/min，进样量为1 L。4.3.4.4 质谱条件 离子源为EI 源，离子源温度200，接口温度250，采集方式TIM，扫描范围40450 amu。4.3.5 毒死蜱的微生物降解特性分析体系4.3.5.1 毒死蜱标准曲线的绘制参照25毒死蜱在各种溶剂中的溶解度（表1-1），选取丙酮作为毒死蜱的溶剂。利用100g/ml毒死蜱丙酮标样分别配制成0.5mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、6 mg·L-1、10 mg·L-1的不同浓度的毒死蜱溶液，以丙酮为参比，在紫外可见光分光光度计上293nm处测其吸光度。然后根据浓度和吸光值作出标准曲线，得出线性方程。4.3.5.2 毒死蜱降解率的计算公式计算公式: 式中：R： 毒死蜱的生物降解率（%）；c： 接菌处理培养液中毒死蜱的浓度(mg·L-1)；cCK：毒死蜱的初浓度(mg·L-1)。 4.3.5.3 毒死蜱微生物降解的特性分析本次毒死蜱微生物降解实验中，,降解试验中毒死蜱浓度为50 mg·L-1，外加碳源（蔗糖）浓度0.3%，PH值为7.5，接种量为5%，培养条件均为30，180 r /min摇床振荡培养,定时取样。分别考察不同PH值、外加碳源浓度、毒死蜱浓度、接种量、培养温度、摇床转速对毒死蜱降解菌降解能力的影响。五外文文献及其中文译文外文文献中文译文短小芽孢杆菌菌株C2A1的毒死蜱降解及其降解产物3，5，6三氯2吡啶-摘要-从土壤中分离出的一种菌株C2A1能高度有效降解毒死蜱及其首要水解代谢物3,5,6 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的。在形态学基础上，生理特性，生化试验和16S rRNA序列分析，应变菌株C2A1被鉴定为短小芽孢杆菌。应变菌株C2A1在毒死蜱降解过程中的降解作用在不同培养条件下进行研究，例如pH，接种密度，浓度存在的添加碳/养分来源和农药浓度。毒死蜱是作为应变菌株C2A1的唯一碳源，相当于葡萄糖，酵母提取物和营养液在体内的代谢作用。在毒死蜱作为降解菌株唯一的碳源、高pH环境（8.5）、高接种密度的条件下，毒死蜱的降解率最大。在其他营养物质的存在时，毒死蜱的降解作用增强可能是由于菌种数量的高增长使毒死蜱更容易被降解从而增加了代谢物的量。该菌株C2A1显示在8天降解期内90的毒死蜱降解为TCP（300mg/L）。1.导言 农药被引入农业实现增加粮食以满足不断增长的全球人口的需求。现在使用农药已成为必然之恶，但这种做法是玩弄人类和混乱其他生命形式。应用农药残留在环境（空气，土壤，地下水和地表水）的持续周期较长1-3 。 由于长期持久性的有机氯农药（林丹，七氯，滴滴涕（DDT）等）及其生物蓄积和对非目标生物的潜在毒性，这系列的农药农药已经被残留相对较少，但持续有效的有机磷（OP）化合物所取代。虽然有机磷降解速度比有机氯快，但是由于它们有能力抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），这类杀虫剂具有急性毒性。乙酰胆碱酯酶可作为一种神经传递调节酶，可在交界处的突触降低乙酰胆碱的浓度。当AChE在突触灭活，例如通过一种有机磷农药，乙酰胆碱的浓度在突触的浓度仍然很高，肌肉或神经纤维持续发生刺激，最终导致衰竭和抽搐4。毒死蜱（O，O-二乙基- O -（3,5,6 -三氯- 2 -吡啶基）硫代磷酸酯）是一种被广泛应用的有机磷畅销杀虫剂，一个重要的经济作物害虫广谱杀虫剂。毒死蜱也可用于控制蚊患（幼虫和成虫），苍蝇，白蚁以及各种土壤和家庭害虫。毒死蜱在土壤中的半衰期通常是60至120天，但根据土壤类型，气候和其他条件也可以从2个星期至1年以上 5。最初，降解农药在碱性土壤中所观察的现象是有关其在高pH值的水解。然而对几个高pH土壤进行消毒，观察到毒死蜱完全抑制水解，从而表明了土壤中微生物的参与6。后来，辛格等人证实了同样的结果7。 如何分离出具有毒死蜱降解能力的纯菌株，这一直是一个问题。这是因为生物降解有机磷农药对抗药性的增强。几个徒劳的尝试通过重复处理或富集土壤样品分离出了毒死蜱降解微生物系统8,9。一般来说，土壤的微生物反复或连续多次遇到人造有毒化学品的发展能力，以降低这些化学物质和微生物等演变特征与新问题，影响农药在土壤中的快速失活 10。毒死蜱生物降解过程中抗性增强的一个可能原因是毒死蜱水解产物3,5,6 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的毒副作用 11。 辛格等人12从澳大利亚的土壤中分离出6株毒死蜱降解菌显示了毒死蜱降解能力的加强。 除了这6株毒死蜱降解菌外，一株肠杆菌同样具有降解这种农药的能力。Li等人分离出一种能够将毒死蜱（100mg/L ）水解成3,5,6-三氯- 2 -吡啶（TCP）的鞘氨醇单属菌。 环境因素如基质的物理和化学特性，营养状态，pH值，温度和生物因素如接种密度会损害任何生物修复过程的完成14,15。据报道，假单胞菌在低pH值和较高有机质的土壤中降解阿特拉津的成功率较低16。而土壤的高pH在毒死蜱降解过程中起到重要的作用7。当接种物种能够降解污染物时，同样的接种量被确定为影响生物修复农药污染点成功或失败的一个可能原因15。要去除农药污染点的污染推荐接种水平为106-108个/克土壤 14。然而，在一项类似的研究中，斯特拉瑟斯等17发现，农杆菌菌株的接种水平低至105个细胞/克土壤也足以迅速降解阿特拉津。农药浓度是生物修复失败的另一个原因18。辛格等19还研究了不同的环境对毒死蜱和苯线磷在土壤条件和水对的生物修复的影响，研究了这两种农药的降解菌株生物修复潜力。毒死蜱主要水解产物3,5,6 -三氯-2吡啶（TCP）的水溶性远大于毒死蜱，导致大规模土壤和水生环境的污染。TCP不仅持续微生物降解，而且由于其抗菌活性限制了毒死蜱的降解9,20,21。相对于TCP降解的重要性，关于毒死蜱在环境中降解步骤的研究还是很少的。在本研究中，芽孢杆菌C2A1菌株不仅能够降解毒死蜱，而且还能分离TCP。生物降解不同浓度的农药毒死蜱和TCP的环境因素，如在根据不同的液体培养，研究媒体和pH值对分离菌株接种量的大小以优化该菌株降解毒死蜱的条件。这项研究旨在阐明一种污染环境中毒死蜱降解菌分离的可能应用.2. 材料和方法 2.1 化学品 分析纯毒死蜱标准品（98.4）来自Ehrenstorfer GmbH（德国）；工业级毒死蜱（95），来自巴中国化工，Lahore； Trichloropyridinol（TCP，99）购买自化学服务网站（Web Chester）。HPLC购买自默克公司。所有使用的其他化学品购自Sigma - Aldrich公司，默克公司或BDH公司。2.2 富集，分离和菌株的选择 土壤样本从全国生物技术和基因工程NIBGE研究所棉花领域采集（如有关农药喷洒广泛）用于农药降解菌的富集，分别在30mg/L和60mg/L（毒死蜱）浓度进行富集。微生物在低盐浓度进行分离（MSM，pH值6.8-7.0），其中（g/L）磷酸氢二钠，5.8；磷酸二氢钾，3.0;氯化钠，0.5；氯化铵，1.0; 和MgSO4，0.25。大约20克的土壤被添加到50毫升含毒死蜱和MSM培养液中，用250毫升锥形瓶在室温下摇床（100转）培养。两周后，回收5mL培养液并移至新鲜的含毒死蜱的培养液中（ 30mg/L和60mg/L）。此后，连续三次转移，进行了新的接种培养，每一次的接种量只有5毫升碳源MSM，每2-4周培养。通过定期增补，使整个实验无菌水水分含量保持在一定范围内。两个星期后，最后转移至10倍稀释的培养液和100 L的每个稀释的含有60mg/L毒死蜱营养琼脂平板（NA）。在NA平板上反复分离含毒死蜱降解菌的菌落，纯化毒死蜱降解菌。一旦所有分离纯化获得到，在含毒死蜱浓度为50mg/L的MSM培养基上培养，测试毒死蜱降解菌对毒死蜱的利用。同时，在37C和100转摇瓶培养，对毒死蜱降解菌在含毒死蜱的MSM培养基中增长状况进行监测。毒死蜱残留浓度在这个阶段利用高效液相色谱法测定。 1株毒死蜱降解菌，指定C2A1，它具有最高的毒死蜱降解能力，被选定作为进一步研究毒死蜱降解。 2.3 分类鉴定的菌株 由威尔逊等人所描述的菌株，基因组总DNA的提取细菌菌株的描述为16S rRNA基因序列22。 16S rRNA基因的扩增采用通用引物，FD1（5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3;大肠杆菌，8月27日）和RP1（5 ACGGHTACCTTGTTTACGACTT - 3，大肠杆菌，1507至1492年）23。PCR产物的组成扩增16S rRNA基因片段，纯化QIAQuick自旋列（QIAGEN公司），并pTZ57R TA克隆载体克隆。在克隆载体转化大肠杆菌Top10和质粒，通过使用核苷酸序列一Fermentas小量DNA纯化试剂盒获得。 2.4 接种的准备C2A1菌株培养在营养肉汤培养基中，用离心机4600转离心5min，用N-生理盐水（0.9NaCl溶液）清洗与灭菌， N -生理盐水菌悬液设定在OD590nm为0.7。菌落形成单位（CFU mL - 1）用稀释平板计数法测定。2%菌悬液被用来作为研究提到接种直到毒死蜱降解。 2.5 提取样本（农药残留的高效液相色谱分析）样品（5毫升）从培养瓶中提取，并用离心机7200转离心10min获得。毒死蜱和3,5,6 -三氯- 2 -吡啶（TCP）的残留量用二氯甲烷（DCM ）提取两次。 DCM的有机层通入空气，在室温下充氮气蒸发。残留物溶解在高效液相色谱级乙腈（1毫升），然后通过flouroporeTM滤膜（0.45m FH）过滤，以去除颗粒。高效液相色谱法分析之前，这些样本如果需要稀释，农药和TCP的滤液浓度高效液相色谱法测定，参阅第2.6及培养基计算。 2.6 HPLC色谱条件与分析提取的样品与三元梯度泵配备1瓦里安高效液相色谱法分析，可编程可变波长紫外检测器，列烤箱，电取样阀和ODS2 C18反相柱。对农药残留进行了分析，采用梯度流动相为乙腈：水：乙酸如前所述24。进样量为20升，流动相的流速1mL/min,毒死蜱是在290nm和320nm波长检测。对毒死蜱和3,5,6-trichloropyridinold 保留时间分别是15min和7.8min。 2.7 降解毒死蜱摇瓶研究工作进