基因组测序技术课件.ppt

基因组测序技术,一些主要模式生物基因组测序概况,1995年 7月，第一个基因组流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的全序列发 表，大小为1.8 Mb；1996年 10月，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因组全部测序完成；1997年 9月，大肠杆菌（Escherichia coli）基因组全部测 序完成，全长5 Mb；2001年 12月，线虫（Caenorhabditis ele gans）基因组测序完成.,一些主要模式生物基因组测序概况,2000年：3月，Celera公司完成果蝇（Drosophila me lanogaster）基因组（180 Mb）的全部测序工作，在当时所有已测序的基因组中是最大的，同时这也证明了“全基因组鸟枪法”的可行性；2000年 12 月，第一个植物基因组拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组被全部测序，大小为125 Mb.,一、测序流程1.构建生物基因组文库或cDNA文库 DNA的提取和制备酶切制备克隆用DNA片段 与载体连接转化受体细胞 筛选鉴定扩增培养。2.从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序：将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增）从细菌中提取出繁殖好的质粒 酶切，制取测序的DNA片段3.测序：上测序仪测序。4.利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。,二、DNA测序的方法双脱氧链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序,（一）Sanger的双脱氧链末端终止法,1.基本原理:通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。,Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无53外切酶活性。,基本原理:,2.技术路线与要求,制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列,A 克隆于质粒中DNA用碱或热变性B M13克隆单链DNAC 噬粒克隆DNAD PCR产生单链DNA,A 高酶活性B 无53外切酶活性C 无35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基,5P,P 5,3HO,OH 3,5P,OH 3,P32 5,5P,OH 3,HO,DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,制备单链DNA,加放射性引物,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,聚合产物分别在4个泳道电泳,从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列,（二）Maxam-Gilbert的化学降解法,1.基本原理 是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。,2 技术路线,将双链DNA样品变为单链 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 电泳,读取DNA的核苷酸顺序,Maxam-Gilbert测序法的特异断裂,AT,ATCGAT,Specific Reaction to G,化學法,無放射線片段不能顯像,Maxam-Gilbert 法所用的化学技术,5P,P 5,3HO,OH 3,5HO,OH 5,3HO,OH 3,532P,P32 5,3HO,OH 3,532P,OH 3,硫酸二甲酯,甲酸,肼,肼NaCl,G,G+A,T+C,C,碱性磷酸单酯酶,除去 5磷酸基,多核苷酸磷酸激酶,-32P-ATP,分离单链DNA,分别在4个试管中进行特异断裂,断裂产物分别在4个泳道电泳,从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列,化学法测序实例,哌啶,改进的特异化学切割反应,（三）自动化测序,1.基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,（四）非常规测序1.毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法.2.光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3-末端时会释放1个焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列.,3.DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.,利用基因芯片进行杂交测序的原理,三、测序及序列的组装的策略,（一）随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”.,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,鸟枪法(Shotgun)测序的问题,CAATGCATTAGCAGCCAATGC,GAP,错装,实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装,超声波打断纯化的基因组DNA 琼脂糖电泳收集1.62.0Kb的区段、纯化 构建到质粒载体中 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,各重叠群间仍有间隙 顺序间隙 物理间隙,载体或宿主菌 选用不当而被丢失的顺序,测序时遗漏的测序,解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库,解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库,序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点:不需预先了解任何基因组的情况.,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段测序,计算机拼装,（二）限制测序,限制测序：是指将一段染色体区段的DNA 顺序进行组装.一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法.如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群,先进行各个BAC克隆的随机测序,再进行序列组装；水稻基因组测序计划采取得策略与此相同.,（三）指导测序与序列组装,建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”,即所谓”指导鸟枪法”或”指导测序”。在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法，其基本步骤如下:A 构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序;B 构建平均10Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序,读取2个端部顺序;C 参考人类基因组图,特别是大量的STS位标作为基点,进行序列组装，排成重叠克隆群.,先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb),利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig),分别测序后拼装.这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.,A,B,C,A,B,C,大片段contig,小片段测序拼装,两种策略的比较,鸟枪法策略 指导测序策略不需背景信息 构建克隆群(遗传、物理图谱)时间短 需要几年的时间 需要大型计算机得到的是草图(Draft)得到精细图谱,（四）其他测序路线,1.重要区域优先测序 人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序.如:人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体,与人类免疫系统有关，因而优先测序.,2.EST(Expressed sequence tag)测序 EST是一种重要的基因组图分子标记,以EST为探针很容易从 cDNA文库中筛选全基因,又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列.优点:A mRNA 可直接反转录成cDNA,而且cDNA文库也比较容易构建;B 对cDNA文库大量测序,即可获得大量EST的序列;C EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次测序的结果足以鉴定所代表的基因;,四、人类基因组计划,人类基因组计划（Human genome project）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。,1.人类基因组计划的目的,阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，并搞清其在染色体上的位置;破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我;解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律;认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。,2.人类基因组草图的完成,2000年6月26日是人类历史上值得纪念的一天。人类基因组的工作草图已经绘制完毕并于这天向全世界公布。最终完成图要求测序所用的克隆能忠实地代表常染色体的基因组结构，序列错误率低于万分之一。,二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成,美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯柯林斯在介绍情况。,人类基因组草图基本信息,由31.65亿bp组成含33.5万基因与蛋白质合成有关 的基因占2%,人类基因组,2000年6月公共领域测序计划工作框架图,2001 年2月16日 人类基因组“精细图”完成，(99%),2003年4月14日 人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%），提前绘制成功,A.Celera Genomics 人类基因组的测序策略,3.人类基因组测序策略,采集5个自愿者的DNA样品,构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb,10Kb和50Kb,完成约2700万次插入子末端测序,总长14800Mb,GeneBank下载104018个BAC末端顺序,PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb,随机测序与序列组装方法和指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装,B 国际人类基因组测序策略构建BAC克隆 限制性酶处理获得指纹 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到物理图上,4.人类基因组测序结果,基因数是3万、4万还是10万 人类遗传基因数量比原先估计的少很多。目前研究表明，人类基因组中约有3万至4万个蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数目的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。此结论是由两大科研小组的数据是从DNA水平上得出的；而“人类有10万多个基因”则是从RNA水平上得出的结论。所以，这些数据不能推翻“人类有10万个基因”的说法。,人类基因组研究的惊人发现,19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠”。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有“无用DNA”不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有14的区域没有基因的片段。353的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是“垃圾”的DNA也起重要作用，应该被进一步研究。,什么是单核苷酸多态性,人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。,5.人类基因组计划的意义,随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究。如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进化，细胞发育、生产、分化的分子机理，疾病发生的机理等。,（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。,（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。,（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。,（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。,（8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。,以人类基因组和拟南芥基因组为例说明你对生物基因组全序测定工作的科学意义与社会意义的认识（8分）中国科学院2002年 硕士学位研究生入学分子遗传学试题,6.人类基因组计划的伦理学,A 个人DNA顺序的隐私权.如:”次等”基因携带者可能受到岐视,职业限制,医疗保险等问题;B 基因专利问题,7.后人类基因组计划,伴随着人类基因组计划的迅速进展，基因的全序列逐步被完整的测出，会出现大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人类基因被定序之后，还需要：破解贮存于基因组之中的遗传语言;识别、分离、鉴定和克隆所有基因；搞清每个基因的功能及基因之间的相互作用和相互关系。,水稻的基因组,2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多。人类基因大约有3-4万个，水稻有46022-55615个基因。因此水稻基因组可说是继人类基因组之后，完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。由于水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。,基因组学概述,基因组（genome），又称染色体组一个物种单倍体的染色体数目，物种全部遗传信息的总和物种遗传信息的“总词典”控制发育的“总程序”生物进化历史的“总档案”,基因组学（genomics）,1986年提出，至今20年，已经发展成为遗传学中最重要的分支学科。对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析,基因组学研究的最终目标,获得生物体全部基因组序列 鉴定所有基因的功能 明确基因之间的相互作用关系 阐明基因组的进化规律,经典遗传学,在20世纪初，遗传学刚刚诞生的时候，遗传学家的工作主要是鉴别感兴趣的基因，确定这些基因在染色体上的位置。第一个环节：寻找自发突变体，或者利用物理、化学因素诱发突变。第二个环节：通过连锁分析确定新基因与已知基因的相互关系，绘制遗传连锁图。,几个代表物种的基因组大小,CREDIT:JOE SUTLIFF,Science,Vol 291:1221.,Fishing in a More Effective Way!,基因组学的研究内容,结构基因组学 功能基因组学 蛋白质组学,结构基因组学（structural genomics）,基因定位 基因组作图 测定核苷酸序列,功能基因组学（functional genomics）,又称后基因组学（postgenomics)基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究,人类基因组计划,1990，美国国立卫生研究所和能源部投资30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版2002，完成测序工作,基因组图谱的构建,基因组计划的主要任务是获得全基因组序列但是，现在的测序方法每次只能测8001000bp大量的测序片段要拼接要知道序列在Chr上的位置才能正确拼接基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱,基因组图谱,遗传图谱（genetic map）物理图谱（physical map）,遗传图谱（genetic map）,采用遗传分析的方法将基因或其它DNA序列标定在染色体上构建连锁图。,遗传标记,有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。包括：形态标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记,多态性（polymophism）,所有的标记都必须具有多态性！花色：白色、红色 株高：高、矮 血型：A、B、O型 淀粉：糯、非糯所有多态性都是基因突变的结果！,形态标记,形态性状：株高、颜色、白化症等又称表型标记数量少很多突变是致死的受环境、生育期等因素的影响,最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。,果蝇连锁图,细胞学标记,明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 染色体的核型 染色体的带型 染色体的结构变异 染色体的数目变异优点：不受环境影响缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利,生化标记,又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。如：同工酶、贮藏蛋白 优点：数量较多，受环境影响小 缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息,DNA分子标记,简称分子标记以DNA序列的多态性作为遗传标记优点：不受时间和环境的限制 遍布整个基因组，数量无限 不影响性状表达 自然存在的变异丰富，多态性好 共显性，能鉴别纯合体和杂合体,限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）,DNA序列能或不能被某一酶酶切，相当于一对等位基因的差异。如有两个DNA分子（一对染色体），一个具有某一种酶的酶切位点，而另一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多态性。可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上。人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。,RFLP分析,RFLP标记位共显性标记,微卫星（microsatellite）标记,微卫星又称为简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）。这种重复序列的重复单位很短，常常只有2个、3个或4个核苷酸如一条染色体TCTGAGAGAGACGC 另一染色体TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就构成了多态性。,遗传图谱的构建方法,理论基础:连锁与交换 基本方法:两点测验法和三点测验法,植物遗传图谱的构建,选择研究材料（亲本）构建分离群体 遗传标记检测 标记间的连锁分析,选择亲本,要求亲缘关系远，遗传差异大 但又不能相差太大以导致引起子代不育。对备选材料进行多态(差异)性检测，综合测定结果，选择有一定量多态性的一对或几对材料作为遗传作图亲本。,构建作图群体,遗传标记的染色体定位,利用遗传学方法或其它方法将少数标记锚定在染色体上，作为确定连锁群的参照系。常用的方法：单体分析 三体分析 代换系分析 附加系分析,标记间的连锁分析,利用在两个亲本间有多态性的标记分析分离群体中所有个体的基因型根据连锁交换的情况，确定标记之间的连锁关系和遗传距离有计算机软件可以应用,水稻遗传图,1994年，水稻第一张高密度遗传图谱 927个位点，1383个标记 1998年，1157个位点，2275个标记 2000年，3267个标记 高密度的遗传图谱为基因组测序和遗传研究奠定了坚实的基础。,人类遗传图谱的构建,不可能根据需要选择亲本，设计杂交组合，构建分离群体！只能检测现存家庭连续几代成员的基因型 家系分析法 资料有限、必须借助于统计学方法,现有的人类遗传图谱,122号染色体 8个家系134个成员 X染色体，12个家系170个成员 5364个SSR标记 2335个位点 标记间的平均距离599kb,物理图谱的构建,用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？,遗传图谱的缺陷,分别率有限 人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体 测序要求每个标记的间隔小于100kb 实际是599kb,遗传图谱的缺陷,精确性不够经典遗传学认为，交换是随机发生的基因组中有些区域是重组热点倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组,酵母遗传图与物理图比较,A 遗传图B 物理图,物理作图的方法,1、限制酶作图2、依靠克隆的基因组作图3、荧光原位杂交4、序列标签位点作图,限制酶作图（restriction mapping）,限制酶作图（restriction mapping）,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）,人类基因组物理图,1987年，RFLP图谱，403个标记，10Mb 1994年，5800个标记，0.7Mb 1996年，17000多个标记，100kb 完全适应全基因组测序的要求,遗传图与物理图的整合,有些标记既是遗传标记，又是物理标记 RFLP标记 SSR标记 某些基因序列借助这些标记可以将遗传图和物理图整合起来,基因组测序策略,有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了测序的技术飞速发展，现在可以全自动化测序的策略有两个：鸟枪法 克隆重叠群法,鸟枪法（shotgun sequencing）,鸟枪法的优缺点,优点：不需要高密度的图谱 速度快、简单、成本低缺点：拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组,克隆重叠群法（clone contig）,将基因组DNA切割长度为0.1Mb1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。这是一种自上而下（up to down）的测序策略 clone-by-clone method,两种基因组测序策略,The E.coli genome,A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons.A dot indicates the promoter for each gene or operon.Arrows and color indicate the direction of transcribtion:dark blue genes are transcribed left to right,light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.,功能基因组学,完成基因组测序，仅仅是基因组计划的第一步，更重要的工作在于弄清楚：基因组序列中所包含的全部遗传信息是什么；基因组作为一个整体如何行使功能。就是对基因组序列进行诠释的过程，也就是功能基因组学的研究内容。,根据序列分析搜寻基因,查找开放阅读框（open reading frame,ORF）开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还要有终止密码子。从ATG开始，然后向下游寻找终止密码子。起始密码子和终止密码子之间的碱基数目要能够被3整除 每一条链都有3种可能的阅读框，2条连共计有6种可能的阅读框.计算机可以很快给出结果。,同源查询,利用已经存入数据库的基因序列与待查的基因组序列比对，从中查找可以与之匹配的碱基序列及其比例，用于界定基因。同源查询可以部分弥补ORF扫描的不足。,同源查询的依据,有亲缘关系的物种，基因组可能存在某种程度的相似性：存在某些完全相同的序列；ORF的排列相似，如等长的外显子；ORF指令的氨基酸序列相似；模拟的多肽链的高级结构相似，等。,基因功能研究,1、计算机预测基因功能 依据仍然是同源性比较。同源基因拥有一个共同的祖先基因，它们之间有许多相似的序列。种间同源基因 种内同源基因,基因功能研究,2、实验确认基因功能 基因克隆 基因敲除（knock-out）基因的超表达 反义RNA技术 RNAi 转座子插入突变,反义RNA（antisense RNA）技术,