第三章真核细胞周期调控的分子机制.ppt
,第十九章,真核细胞周期调控的分子机制,唐旭东,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖,第一节,细胞周期及调控的概述,细胞周期,间期(interphase),分裂期(M),G1期(合成前期)S期(DNA合成期)G2期(合成后期),前期(prophase)中期(metaphase)后期(anaphase)末期(telophase),一、细胞周期(cell cycle),有丝分裂,(mitosis),胞质分裂(cytokinesis),细胞周期的不同时相(phase),G0,裂殖酵母,二、细胞周期调控的主要分子机制,细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体 包括二个亚单位：调节亚单位：细胞周期蛋白（cyclin）cyclin浓度随细胞周期不断变化催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)-CDK单独存在时无活性，与cyclin结合才具有激酶的活性;-cyclin不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化。,三种控制细胞周期进程的细胞周期蛋白-CDK复合体：G1、S期和有丝分裂-CDK复合体（G1-CDK复合体的合成和活性的调节是细胞周期的主要调控机制）前复制复合体（pre-replication complex，pre-RC）：其磷酸化既可启动DNA的复制，又可防止新的前复制复合体组装翻译后调节机制：蛋白磷酸化、泛素依赖的蛋白降解,三、研究细胞周期调控的实验体系,（一）细胞的DNA含量提示其所处的细胞周期时相 用与DNA结合的荧光染料处理细胞，再用流式细胞术(FCM)测定每一细胞的DNA含量。荧光激活的细胞分选仪（FACS)（二）细胞融合实验（三）互补实验,Control,Drug-treated,细胞周期阻滞于S期,细胞周期阻滞于G2期,参与细胞周期调控的分子,第二节,一、细胞周期蛋白（cyclin）,种类：目前分离出30余种 脊椎动物：A1-2、B1-3、C D1-3、E1-2、F、G、H等 人类：A、B、C、D、E。分类：不同时相发挥作用 G1周期蛋白：在G1期发挥作用（C D E）（S和）M期周期蛋白：A B 在G2/M调控点发挥作用,一、细胞周期蛋白（cyclin）,共同结构：均含有一段约100150个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒（cyclin box)，是与CDK结合的关键区。功能：不同的cyclin识别不同的CDK，组成不同的cyclin-CDK复合物，表现出不同的CDK激酶的活性。,G1周期蛋白,表达顺序：先cyclin C D，再cyclin Ecyclin D和E，为细胞通过限制点所必需cyclin D亚类：D1 D2 D3cyclin D CDK：4、6cyclin D功能：使下游蛋白磷酸化 如：CDK4/6-cyclin D使视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化,释放转录因子E2F,促进CDK2、cyclin E表达,进一步磷酸化Rb,阳性反馈回路,*此时细胞周期不依赖CDK4/6-cyclin D复合体的活性,细胞周期的调控,CDK1/Cyc B,*Cyclin D 和E在G1期表达，为细胞通过限制点所必需,S和M期周期蛋白,合成顺序：A早于B（1）cyclin A：与CDK1和CDK2形成复合物（2）cyclin B亚类：B1 B2 B3合成：在胚胎细胞周期中连续合成，但在有丝分裂后期（晚期）迅速降解。？CDK：1,二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）,种类：目前动物中发现9种，人类7种（17)共同结构：相似的激酶结构域，是一段保守序列，与周期蛋白的结合有关。至少有两个结构域：T-loop、ATP结合位点激活：Cyclin与CDK结合为CDK发挥酶活性所必需但CDK 仅与Cyclin 结合并不能使CDK激活只有T-loop 中的Thr161残基磷酸化才能使CDK激活。,二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）,功能：在不同细胞时相，特定的CDK与特定的cyclin形成细胞周期特异的蛋白激酶复合体，调节细胞周期进程。激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。,脊椎动物细胞CDK-细胞周期蛋白复合体,CDK 细胞周期蛋白 功能,CDK1 cyclinB1,B2,B3 有丝分裂 cyclin A G2/MCDK2 cyclin A S期 cyclin E G1/SCDK3？G1/S?CDK4/6 cyclinD1,D2,D3 G1期,三、泛素与APC,泛素（ubiquitin)组成和分布：由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；作用：共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。,把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要3个酶:泛素激活酶(E1):泛素-COS-Cys-E1(活化)泛素结合酶(E2):泛素-COS-Cys-E2(转硫酯）泛素连接酶(E3):泛素-CONH-Lys-底物蛋白(标记)泛素与被选择降解的蛋白质形成共价连接，使后者标记并被激活，称为泛素化。蛋白酶体可迅速将泛素化的底物蛋白降解后期促进复合体（anaphase promoting complex，APC）就是一种E3,可将泛素连到M期周期蛋白上,作用机制：,分裂期周期蛋白B的N端有一段序列与其降解有关，称破坏作用盒(destruction box)；APC使E2-泛素复合体找到破坏作用盒，并将泛素转移到位于盒C端的Lys残基；泛素化-多泛素化 共价结合一串泛素的过程，称为多泛素化(polyubiquitination)。周期蛋白B被蛋白酶体识别而降解,周期蛋白B(cyclin B)如何降解？,细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径,其他蛋白的降解,G1期周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破环作用盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。PEST序列：指富含脯氨酸（P)、谷氨酸（E)、天冬氨酸、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)的残基序列缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor 1，HIF-1),Expression and activation of HIF-1 are regulated by the oxygen concentration*Under normoxic conditions:hydroxylation interaction with von Hippel-Lindau(pVHL)pVHL is an important component of the E3 ubiquitin ligase complex.ubiquitinization and degradation*Under hypoxic conditions:Inhibition of hydroxylation Suppression of degradation accumulation,Hypoxia inducible factor 1(HIF-1),四、生长因子(growth factor),生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种；多数有促进细胞增殖的功能，故又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）等；少数具有抑制作用（或称生长抑制因子）如抑素(chalone)、肿瘤坏死因子（TNF）、c-mos原癌基因产物、p39mos(Mos)。,生长因子的作用机理,五、周期蛋白-激酶抑制因子（CDK-kinaseinhibitor，CKI）,CKI对细胞周期起负调控作用CKI分为两大家族：INK4(Inhibitor of kinase 4)家族 CIP/KIP 家族 CIP:CDK inhibitory protein KIP:Kinase inhibitory protein,一、INK4 家族的CKI,包括：P16(INK4a)、P15(INK4b)、P18(INK4c)、P19(INK4d)共同结构：4个锚（ankyrin）重复序列CDK：识别CDK 4、6，不识别CDK 2功能：通过与cyclin D竞争结合CDK 4而引起细胞周期在G1期停滞,一、INK4 家族的CKI,（一）P16功能：结合CDK4和CDK6，抑制CDK-cyclin D复合体的催化活性使细胞周期在G1期停滞意义：P16的严格调节对维持细胞的正常生长是必需的 常在肿瘤和癌细胞中缺失或灭活（甲基化）,一、INK4 家族的CKI,（二）P15诱导剂：转化生长因子（TGF-）意义：甲基化使P15启动子沉默在血液恶性病变中起重要作用P15的异常甲基化对估计预后具有意义,P15和P16都具有抑制端粒酶活性和抑制细胞生长的作用（具有肿瘤抑制作用）,二、CIP/KIP 家族的CKI,包括:：P21(CIP1/WAF1/SDI)、P27(KIP1)、P57(kip2）等共同结构：N端CDK抑制性功能域功能：抑制CDK2-细胞周期蛋白A和CDK2-细胞周期蛋白E的激酶活性。过多表达引起G1期细胞周期蛋白停滞。P21和P27是CDK4的激活因子。,（一）P21,结构特点：启动子上有P53结合位点功能：DNA损伤时G1期停滞的关键性决定因素在G2/M转折中起作用参与细胞的终末分化和衰老与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。表达调节：P53的转录激活调节P53-非依赖的调节：P202、STAT信号通路、癌基因产物的负性调节（c-Myc、Set、Her2）,（二）P27,表达调节：上调信号：phosphatase and tension homolog(PTEN)Forkhead转录因子(Afx、Fkhr、Fkhr-L1）下调信号：CpG岛过度甲基化 癌蛋白（c-Myc、Her2)（三）P57 在Beckwith-Wiedeman综合征（BWS)中丢失受IGF-II的负调节,三、新的CKI-14-3-3,14-3-3家族的成员之一与细胞分裂周期(cell division cycle，CDC)有关的基因CDC2、CDK2和CDK4相互作用抑制CDK活性阻断细胞周期进展,Cell cycle主要直接依赖于一系列异二聚体蛋白激酶复合体的调节；蛋白激酶复合体的活性依赖于各种cyclins的合成与降解；Cyclins的合成受各种生长因子影响；Cyclins的降解与泛素降解途径有关；蛋白激酶复合体的活性还受CKI抑制。,小结,第三节,细胞周期的运行,细胞周期和其他的一些细胞生理过程就像多米诺骨牌,细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达；并与CDK4、CDK6结合而活化激酶；G1-CDK使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F；促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK12的基因。在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。,一、细胞周期的启动（G0G1）,生长因子促进细胞进入细胞周期,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,二、DNA复制（G1S）,在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。DNA的复制是由复制起始点（origins of replication）开始的;复制起始点也就是自主复制序列，散布在染色体上;在整个细胞周期中，复制起始点上结合有起始识别复合体（Origin recognition complex,ORC）;,CDC6是一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高;细胞分裂周期(cell division cycle，CDC)基因CDC6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的小染色体维持蛋白（mini-chromatin maintenance protein,MCM）复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-RC）;-MCM实际上就是DNA解螺旋酶（helicase）,起始识别复合体,起始复制点,S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制;因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC;磷酸化的CDC6随后被SCF(skpi-cullin-F-box protein)参与的泛素化途径降解；(SCF复合体将泛素连接到G1/S期cyclin)S-CDK还可以将某些MCM磷酸化，使其被输出细胞核;其它一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成，从而保证了DNA仅复制一次。,每条染色体在一个细胞周期仅复制一次,三、进入M期(G2-M),在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，形成 M-CDK；M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累，在胚胎细胞周期中cyclin一直在合成，其浓度决定于降解的速度；但在大多数细胞的有丝分裂周期中，cyclin的积累是因为在G2-M期M-cyclin基因转录的增强;,随着M-cyclin的积累，结合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是没有活性;-因为抑制因子Wee1激酶将CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化#52-这种机制保证了CDK-cyclin能够不断积累，然后在需要的时候突然释放。#53.,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Thr 161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase,CAK)的作用下完成的,在M期，一方面Wee1的活性下降;另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍;CDC25可被两种激酶激活，一是polo激酶，另一个是M-CDK本身;激活的M-CDK还可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一个正反馈循环;只要有少量的CDK1被CDC25或polo激酶激活，立即就会有大量的CDK被活化。,在中期当成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)或称为有丝分裂和减数分裂促进因子（mitosis and meiosis promoting factor,MPF)活性达到最高时，激活APC;APC将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解;完成一个细胞周期。,Cyclin B的降解途径,第四节,细胞周期检验点与周期阻滞,细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂;细胞周期的运行，是在一系列称为细胞周期检验点（check point）的严格监控下进行的;检验点的作用：当DNA受到损伤时,复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。检验点的组成：由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成。,主要检验点有：G0/G1检验点:控制从静止状态的G0期进入G1期G1/S检验点:在哺乳动物中称限制点(restriction point)或简称 R点，控制细胞由G1进入DNA合成期。#17 细胞可能的3种命运：继续增殖、暂不增殖、不增殖而分化S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点。相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会引起细胞周期中断。,主要的检验点,第五节,细胞周期与癌症,促细胞周期进展,细胞增殖、分裂,Rb、E2F与肿瘤,在哺乳动物细胞中，G1期受正性和负性调节信号的严格控制；Rb通过细胞周期依赖性的磷酸化/去磷酸化监控这些信号，决定细胞是否通过G1期检验点、是否进行分裂；Rb对细胞周期的调控是通过转录因子E2F来实现的；至少有1/3的人类肿瘤存在Rb基因缺失或突变。,CDK4-Cyclin D2(有Kinase活性),Rb-E2F,ATP,ADP,促转录(如myc,DNA聚合酶),Rb-P,+E2F,Rb调节细胞周期,DNA Damage,GADD45,BAX,DNA Repair,P53与肿瘤,Cyclin D/CDK4,Apoptosis,G1/S block G2/M block,Cell Cycle Arrest,14-3-3与肿瘤,14-3-3受P53诱导，参与DNA损伤的调节，在P53非依赖的调节机制中可能起作用功能丧失促进恶性转化P27与肿瘤表达下降与癌症的发生和低存活有关，是癌症进展的标志表达下降可能与泛素介导的降解增加有关受c-Myc的调节,谢谢！,
