武汉大学分析化学第五版第10章吸光光度法.ppt

第10章：吸光光度法,10-1 物质对光的选择性吸收和光吸收定律10-2 分光光度计及吸收光谱10-3 显色反应及影响因素10-4 吸光光度分析及误差控制10-5 其他吸光光度法10-6 吸光光度分析法的应用,许多物质具有颜色，还有些物质能形成颜色.例如MnO4-粉红Cr2O72-橙黄FeSCN2+血红而且颜色深浅与浓度有关,定义：是基于被测物质对光具有选择性吸收的特性而建立的分析方法。包括：比色法、可见及紫外吸光光度法、红外光谱法等。本章我们重点讨论可见光区的吸光光度法。,吸光光度法,特点,灵敏度高 最低浓度一般可达1-10-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-4%。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。准确度较高 相对误差为2-5%，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。操作简便，测定速度快 应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。,光的基本性质,光的电磁波性质,可见400800400 500 600 700 800 紫蓝 绿 黄 橙 红,10-1 物质对光的选择性吸收和光吸收定律,光的波粒二象性,波动性,粒子性,E,光的折射,光的衍射,光的偏振,光的干涉,光电效应,E：光子的能量（J,焦耳）,：光子的频率（Hz,赫兹）,：光子的波长（cm）,c：光速（2.99791010 cm.s-1）,h：Plank常数（6.625610-34 J.s 焦耳.秒）,单色光、复合光、光的互补,单色光,复合光,光的互补,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,白光色散,吸收光谱,光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关。,物质对光的吸收,物质对光的吸收满足Plank 条件,10.1.1 物质对光的选择性吸收,1.吸收光谱的产生,(1)原子吸收光谱(AAS)：由于原子外层电子选择性地吸收某种波长的电磁波，而引起的吸收光谱（线光谱）(2)分子吸收光谱：是由分子中电子能级及分子的振动、转动能级吸收能量跃迁而产生的吸收光谱（带光谱）,a)电子光谱：由价电子跃迁而产生的分子光谱，且电子能级差 1-20eV，位于 UV-ViS波区200-750nm（紫外可见吸收光谱）,b)振转光谱：电子能级变化时，伴随着分子的振动，转动能级的变化，能级差0.05-1eV，IR(红外线)0.75-2.5m 研究分子结构，提供分子结构信息如C=O振动，=1600-1750cm（红外光谱）,2.物质的颜色,溶液颜色与吸收光颜色及波段的关系,黄绿 紫 400-450 黄 蓝 450-480 橙 绿蓝 480-490 红 蓝绿 490-500 紫红 绿 500-560 紫 黄绿 560-580 蓝 黄 580-600 绿蓝 橙 600-650 蓝绿 红 650-750,物质对光的吸收,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。如图所示，设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。,10.1.2:光吸收定律朗伯-比耳定律,在吸光光度分析法中，试液和空白溶液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，然后让强度为I0的单色光分别通过这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。入射光强与吸收和透过光强关系为下式,透过光强度It与人射光强度Io之比称为透射比或透光率（度），用T表示。溶液的透射比愈大，表示它对光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它对光的吸收愈大。,透射比或透光率（度）,T 取值为0.0%100.0%,1.Lambert-Beer Law 数学表达式：A=Kbc,定义：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比,A1 b1 若：c 一定时=.Lambert Law A2 b2,A1 c1 b一定时=.Beers Law A2 c2,朗伯-比尔定律适用于任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质,2.吸光度A的加和性,若溶液中含有不止一种吸光物质，则总吸光度等于各个组分吸光度之和：A=A1+A2+.+An 根据这一规律，可以进行多组分的测定及某些化学反应平衡常数的测定,3.A与T之间的关系：,吸光系数 Absorptivity,b：吸光液层的厚度，光程，cm,c：吸光物质的浓度，g/L,mol/L,K：比例常数,入射光波长,物质的性质,温度,取值与浓度的单位相关,c：mol/L,K,摩尔吸光系数，L mol 1 cm-1,c：g/L,K a,吸光系数，L g 1 cm-1,c：g/100 mL,K,比吸光系数,相互关系,A A=当b=1时：=.标准曲线的斜率 b c c,朗伯-比尔定律一般适用于浓度较低的溶液，因此在分析实践中，不能直接取浓度为1mol/L的有色溶液来测定值，在适当的低浓度时测定该有色溶液的吸光度，通过计算求得值；,摩尔吸光系数反映吸光物质对光的吸收能力，也反映用吸光光度法测定该吸光物质的灵敏度，在一定条件下它是常数。,3.影响值大小的因素,(1)入射光波长(2)与被测物质有关(FeSCN，=200；Fe phen 1.1 104)(3)温度，酸度，介质，有色物结构(4)不随 c或A值变化,4.值的计算,小结：,a，与c或A无关max104L mol-1 cm-1 用光度法测定具有较高的灵敏度max103L mol-1 cm-1不宜用光度法测定,例如已知含Fe2+12.5g/25mL，用邻二氮菲显色后形成Fe(Phen)3 用2cm比色皿在508nm测得A=0.19，求=？,解,12.510-6 12.510-6(g)MFe(g/mol)25Fe2+=cFe=/=25mL 1000 M 1000,=8.9510-6mol/L,5.桑德尔灵敏度S,当光度检测器的检测极限为A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质最低含量（单位：g/cm2）。,0.001A=0.001=bc cb=,0.001 M S=M 103=(g/cm2),所以上式中的灵敏度：,M 55.85 S=0.005g/cm2 1.1104,单位：Lmol-1cm-1,例某试液用2.0cm比色皿测T=60%，若改用3.0cm，求T%和A,解b=2cm时，T=60%，A=-lgT=-lg0.60=0.222=c b c=A/b=0.222/2.0=0.111,b=3cm时，A=c b=0.1113.0=0.333 T=10-A=10-0.333=0.46=46%,常数,10.2 分光光度计及吸收光谱,光源,单色器,吸收池,检测器,显示装置,A0,At,参比,样品,A=At-A0,10.2.1分光光度计,分光光度计组件,光源,单色器,样品池,检测器,信号输出,钨灯，360 800 nm.同时配有稳压器,基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定,作用：将复合光色散成单色光,棱镜,光栅,玻璃，350 2500 nm,石英，185 4500 nm,平面透射光栅，反射光栅,玻璃，光学玻璃，石英,作用：将光信号转换为电信号，并放大,光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）,表头、记录仪、屏幕、数字显示,10.2.2吸收光谱,It,将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测量每一波长下，有色溶液对光吸收的强度(A)，作 A-曲线图,吸收光谱反应了不同物质的不同特征吸收：,(1)同一物质对不同波长的光的吸收强度不同，吸收最强对应的波长称为max(2)同一物质浓度一定时，在某波长下吸收强度一定，浓度不同吸收强度不同，c愈大，A愈大，c3c2c1是光谱定量的依据(3)同一物质分子运动的形式相同，结构相同，吸收曲线的形状相同，且max位置不变,(4)不同物质的吸收曲线形状不同，决定了物质的结构分析的依据，即定性依据,(5)若选择在max处测量A，则灵敏度高(6)从吸收光谱曲线得出结论：c愈大，颜色愈深，吸收光愈强，Ia愈大，透光It愈弱；c愈小，则相反,c增大A增加T减小 值不变 max不变,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收,在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,A=Kc,选择参比的原则：,(1)当试液及显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比(2)显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液(3)显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液(4)显色剂，待测物有吸收，应掩蔽，使其不与显色剂作用(5)改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰,10.3 显色反应及其影响因素,10.3.1.显色反应和显色剂,1.显色反应的选择 1).灵敏度高，应大于104；2).选择性好，干扰小，或干扰容易消除 3).有色化合物组成恒定，符合一定的化学式 4).有色化合物性质稳定 5).有色化合物与显色剂之间的颜色差较大 max大于60nm,2.显色剂,1).无机显色剂：SCN-Fe3+，MoV，Co2+MoO42-Si，P，V，Ge，As H2O2 Ti TiO(H2O2)2+黄,应用不多，原因：生成的络合物不稳定 灵敏度和选择性不高,2).有机显色剂,应用多，原因 灵敏度高，max104 稳定性好 选择性好 扩大应用范围,生色团：分子中含不饱和键基团，吸收200nm的光 N=N;C=O；C=S;NO2;N=O,助色团：含有孤对电子的基团，与生色团上的不饱和键作用，影响化合物对光的吸收，使颜色加深,NH2；RNH；R2N；OH,配合物显色原因,(b)丁二铜肟，NN型,=1.3104,(c)1，10-二氮菲，NN型,=1.1104,(a)磺基水扬酸，OO型螯合显色剂,.ssal,=1.6103Lmol-1cm-1,(d)二苯硫腙：,=6.6104,(e)偶氮胂III(钠试剂)，变色酸偶氮类,(f)络天青S(三苯甲烷类螯合剂),=530nm=5.9104L/mol cm,3.多元络合物,a 混配合物：由一种金属离子与两种不同配体通过共价键结合成的三元络合物。,b 离子缔合物：金属离子首先与配体生成配阴离子或配阳离子，然后再与带反电荷的离子生成离子缔合物,c 金属离子-配体-表面活性剂体系：某些金属离子与显色剂反应时，加入表面活性剂，可以形成胶束化合物，测定的灵敏度显著提高,10.3.2.影响显色条件的因素,1.显色剂用量,2.溶液的酸度,3.显色温度,4.显色时间,6.溶剂,7.干扰离子的影响,1.显色剂用量：为保证反应完全，R过量，且不宜过多,用量范围宽,用量范围窄,严格控制R量,2.溶液的酸度,(1)影响显色剂的平衡浓度和颜色,cR R=R(H),(2)影响金属离子的存在状态,cM影响显色的同时降低M=M(OH),(3)影响络合物的组成,显色反应酸度由实验测得：,2 9,3.显色温度：许多反应室温完成，有些要加热,红色,蓝色,温度选择由实验确定：,1 2 310 20,4.显色时间：有的要10-30min，有些瞬间完成；稳定性30min，有的稳定60-120min,时间/min,5.溶剂（介质不同，溶解度不同）,6.干扰离子的影响,(2)本身有色：Fe3+，Ni2+，Cr3+，Cu2+，Co2+等,10.4.吸光光度分析及误差控制,1）入射光波长的选择：无干扰-最大吸收的原则max，灵敏度高 有干扰-“吸收最大，干扰最小”的原则。,10.4.1.测定条件的选择和标准曲线的制作,4）吸收池校正：参比池、样品池交换。A 1%,1.测定条件的选择,2）控制吸光度读数范围：调 c或b，使A介于0.2-0.8之间，测量的准确度较高。,3）参比溶液的选择:选合适的参比溶液,调仪器A=0，T=100%。,1）选择合适的显色反应和显色条件 2）绘出被测组分的吸 收光谱曲线(用标液)3）在max下测一系列标准溶液 的A值，绘制工作曲线A-c 4）与工作曲线相同的方法，测未知物AX，从 工作曲线上查cX,2.标准曲线的制作,A,A,标准曲线不过原点的原因1）参比溶液选择不当2）吸收池厚度不同3）吸收池位置不妥4）吸收池透过面不清洁5）显色不完全,10.4.2.对Lambert-Beer Laws的偏离,对吸收光谱而言，b 和 c 固定，,反映了 随波长变化的情况，单一波长，固定；不同波长，不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。,在实际工作中，入射光通常具有一定的通带。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定，有较高的灵敏度。,1 对应的 1较小,2 对应的 2较大,使用比较好的单色器,1.由于非单色光引起的偏离,2.溶液介质不均匀引起的,3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离,1）解离2）络合反应3）其他反应,产生胶体或发生浑浊，会有部分光强因散射等原因而损失,试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定，使得标准曲线严重偏离朗伯-比尔定律消除方法 1）控制溶液酸度 2）加入掩蔽剂 3）改变干扰离子的价态 4）选择合适的参比溶液 5）增加显色剂用量 6）分离,显色反应的干扰及其消除方法,例如：用二苯硫腙法测定Hg2+时，多种干扰离子均可能发生反应，但如果在稀酸介质中进行萃取，则上述离子不再与二苯硫腙作用。,例如：用二苯硫腙法测定Hg2+时，即使在稀酸介质中进行萃取，仍不能消除Ag+和大量Bi3+的干扰，加入KSCN掩蔽Ag+，EDTA掩蔽Bi3+,例如：用铬天青S测定Al3+时，Fe3+有干扰，加入抗坏血酸将Fe3+还原为Fe2+后，干扰消除。,10.4.3:吸光度测量的误差,误差来源 各种化学因素所引入的误差，仪器精度不够，测量不准所引入的误差。,仪器测量误差 光源的发光强度不稳定 光电效应的非线性 电位计的非线性、杂散光的影响 滤光片或单色器的质量差(谱带过宽)比色皿的透光率不一致 透光率与吸光度的标尺不准 对给定的光度计来说，透光率或吸光度的读数的准确度是仪器精度的主要指标之一，也是衡量测定结果准确度的重要因素。,若测A时产生微小的绝对差dA，则相对误差Er为：Er=dA/A；A=bc当b一定时，两边微分得：dA=bdc dA/A=dc/c=Er,仪器测量误差,与T的关系如何？,透射比的读数误差。光度计的读数标尺上透射比T的刻度是均匀的，故透射比的读数误差T（绝对误差）与T本身的大小无关，对于一台给定仪器它基本上是常数，一般在0.002-0.01之间。,在实际测定中，只有使待测溶液的透射比T在15%-65%之间，或使吸光度A在0.2-0.8之间，才能保证测量的相对误差较小，当A=0.434或T=36.8%时，测量的相对误差最小。可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池来达到目的。,10.5 其他吸光度法,10.5.1目视比色法,步骤：1.用同质材料的比色管 2.配制不同量的标准溶液 3.同量的显色剂，相同的实验条件，配成一套标准色阶 4.待测物与标准色阶的配制条件相同，置于色阶中比较 颜色度,方法优点：简便，野外、现场操作；不符合朗伯-比尔定律的也可测 方法缺点：准确度不高。不可分辨多组分,定义：用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法,目视比色法,目视比色法与分光光度法比较,原理不同：吸光光度法与目视比色法在原理上不同。分光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过光的强度。例如，测KMnO4的含量，分光光度法测量的是KMnO4溶液对黄绿色光的吸收情况，目视比色法则是比较KMnO4溶液透过红紫色光的强度。,10.5.2 示差吸光光度法,低浓度示差吸光光度法,高浓度示差吸光光度法,使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法,以高浓度示差吸光光度法为例,原理：以稍低于待测组分浓度的标准溶液作为参比溶液，然后测试液的吸光度，再从A求c，从而提高准确度参比液 cS cX样品液,则 AS=b cS AX=b cX A=A相对=AX-AS=b(cX-cS)=bc相对 用cS参比液调“0”，而后测A值，实际是试样与参比之差A与两者的浓度差c成正比 故：cX=cS+cX,高浓度示差吸光光度法,如果参比T%=10，现调成至100%(A=0)，等于把仪器透光率扩10倍，测量误差变小了。,示差吸光光度法的误差,例:以试剂为空白参比调T=100%，测某有色液A=1.301，假设T=0.003，求光度测量误差Er=？若以T=10%为参比，示差光度法测该试液的T=？此时Er又为多少？,解：已知T=10-A=10-1.301=0.050=5.0%,降低10倍,试剂空白为参比：,T=10%为参比：,准确度大大提高，最小误差可达0.3%，可用于常量分析。所需光源必须是大发射强度，需要专门设计，应用受到限制。,特点,双光束光度计：折光器将一束光分成两类，分时交替地照射样品池（克服光源不稳定而引起的测量误差）1.双波长光度法作用原理：,10.5.3.双波长分光光度法,设1和2两束单色光强度相等，则有：A1=1bc，A2=2 bc所以 A=A1-A2=(1-2)bc,单波长吸光光度法：采用双光束光路，用溶剂或空白溶液作参比调零位,双波长吸光光度法：只用一个样品池。,参比和试样的液池位置、液池常数、溶液浑浊度及溶液组成等任何差异都会直接导致误差,以试液本身对某一波长的光的吸光度作参比，不仅避免了试液与参比溶液或两吸收池之间的差异引起的误差，还可提高测定的灵敏度和选择性。,2.双波长吸光光度法的应用：,测量波长：配合物吸收峰对应的波长,参比波长：显色剂的吸收峰对应的波长,等吸收点处的波长,有色络合物吸收曲线下端的某一波长,a).单组分测定：,两组分的三种叠加情况,b).两组分共存时的分别测定：,选择参比波长和测定波长的条件是：待测组分在两波长处的吸光度之差要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样测得的吸光度差只与待测组分的浓度称线性关系，而与干扰组分无关，从而消除了干扰。,等吸收点-作图法,2 1 1,Y X A相等,1：参比波长2：测量波长消除Y干扰,c）混浊试液中组分测定：试液为参比（不同波长=40-60nm）消除试液中散射光的影响。,10.5.4 导数分光光度法导数分光光度法是利用自动电路对光谱进行求导，其导数信号与浓度成正比，即,同样高阶导数光谱信号也与浓度成正比。导数光谱可以消除干扰物质的光谱重叠、胶体和浑浊溶液对光散射及背景吸收的影响。,奇数阶导数光谱中的零，偶数阶导数光谱中的极值（极大或极小），对应于常规吸收曲线上的最大值。,随着导数阶数增加，吸收峰的尖锐程度增大，带宽减小，因此有利于重叠峰的分离、有利于弱吸收峰的测定、并能准确地确定宽吸收带上的最大吸收波长。此外应该明确的是：导数光谱的分辨率随导数阶数的增加而增加，信噪比随着导数阶数的增加而减小。导数峰的测量有：,p,t,z,A,随着导数阶数增加，吸收峰的尖锐程度增大，带宽减小，因此有利于重叠峰的分离、有利于弱吸收峰的测定、并能准确地确定宽吸收带上的最大吸收波长。此外应该明确的是：导数光谱的分辨率随导数阶数的增加而增加，信噪比随着导数阶数的增加而减小。导数峰的测量有：,峰谷法,基线法,峰零法,10.6 吸光光度分析法的应用,10.6.1 痕量金属分析 对痕量金属元素的定量分析是吸光光度法的一个重要应用领域；几乎所有的金属离子都能与特定的化学试剂作用形成有色化合物，通过吸光光度法可对金属离子进行测定。,10.6.2 临床分析,传统的比色反应技术，在临床分析中得到广泛应用。例如：血清中的尿素或葡萄糖、酶或胆甾醇,10.6.3 食品分析,水果汁中果糖的测定,研究发现:果糖在盐酸的作用下可生成甲基糠醛，通过对果糖在盐酸介质中的吸收光谱进行扫描，发现在波长291 nm处有最大吸收;果糖浓度在0一30 g/mL范围内服从朗伯-比尔定律。利用该方法用紫外分光光度法可以测定苹果鲜汁、鸭梨鲜汁和橘子鲜汁中的果糖含量。通过研究发现该方法具有很好的选择性和较高的灵敏度，适用于组成较复杂的分析对象中的果糖含量测定。该方法具有简便、快速、灵敏，对环境不造成污染，样品无需预处理等特点。,运用一阶导数紫外分光光度法直接测定食品中的硝酸盐，以干扰物亚硝酸盐的一阶导数值为0处的波长作为待测物硝酸盐的测定波长。结果表明，硝酸盐浓度在0一5 g/mL范围内符合朗伯-比耳定律;以一阶导数值对硝酸盐浓度作线性回归，回归系数在0.9983一0.9998之间。该法最低检出限为2ng/mL，灵敏度较高.,食品中硝酸盐的测定,1.弱酸和弱碱解离常数的测定,例如一元弱酸 Ka 的测定,H+A-Ka=HA,做法：先配 c总=cHA+A相等而pH不同的HA溶液，用pH计测各个溶液的pH值，然后在maxHA，MaxA-用b=1cm，测定各溶液的A值,HA=H+A-,10.6.4 其他应用,A=HAHA+A-A-,=HA c HA+A-cA-,H+Ka=HA c+A c(1)H+Ka H+Ka,设：高酸度，pH小，弱酸全部以酸的形式存在，即 c=HA，从而测AHA=HA c 低酸度，pH大，弱酸全部以共轭碱形式存在，即 c=A-，从而测AA=A c,(1)式整理：,AHAH+AA-Ka A=+.(2)H+Ka H+Ka,故：H+A-AHA-A Ka=H+.(3)HA A-AA-,(3)取负对数：A-AA-pKa=pH+lg.(4)AHA-A,2.配合物组成的测定,1.摩尔比法（饱和法）做法：固定 cM，改变 cR，就可得一系列 cR/cM值不同的溶液，测A作图,n,A,曲线转折点不敏锐，是由于络合物解离造成的,2.等摩尔连续变换法,做法：cM+cR=c，改变 cM与 cR的相对比值，使 cM:cR=10:0，9:1，8:2.1:9，0:10,n,此法适用于只形成一种组成且解离度较小的稳定络合物,3.斜率比法 4.平衡移动法,