铜绿假单胞菌.ppt.ppt
铜绿假单胞菌及其耐药机制,彭咏麟,一.非发酵菌、假单胞菌,二.铜绿假单胞菌,主要内容,三.细菌常见耐药机制,第一部分 非发酵菌、假单胞菌,1.非发酵菌(Nonfermentative Bacilli)：一群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厌氧、革兰阴性无芽胞杆菌。葡萄糖氧化发酵试验（O/F）,溴甲酚紫,1 非发酵菌主要特点：氧化酶：（不动杆菌属除外）O/F试验：O/动力试验：多数有鞭毛，但半固体动力试验 不明显，常采用镜检或鞭毛染色。2非发酵菌分类：假单胞菌属 产碱杆菌属 不动杆菌属 黄杆菌属 莫拉杆菌属 窄食单胞菌属 金氏杆菌属 艾肯菌属 土壤杆菌属 丛毛单胞菌属 等,3非发酵菌的分离率：,4非发酵菌与肠道杆菌、弧菌科区别,2.假单胞菌科：根据rRNA-DNA同源性分为5个rRNA群 rRNA群/假单胞菌属 rRNA群/伯克菌属 rRNA群/丛毛单胞菌属、食酸菌属 rRNA群/短波毛单胞菌属 rRNA群/窄食单胞菌属 其它：鞘氨醇单胞菌属、希瓦菌属等,1假单胞菌属（Pseudomonas）种类：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，PA)荧光假单胞菌(P.fluorescence)恶臭假单胞菌(P.putica)斯氏假单胞菌(P.stutizeri)曼多辛假单胞菌(P.mendocina)产碱假单胞菌(P.alcaligenes)假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes),2假单胞菌属共同生物学特性：G-b 菌体细长 单端鞭毛或者丛鞭毛 无芽胞 专性需O2 营养要求不高 35生长，少数4、42 生长 葡萄糖O/动力+氧化酶+过氧化酶+Mac生长,抵抗力：较强，对多种抗生素耐药 临床意义：分布广泛，条件致病菌，主要引起皮肤粘 膜受损部位感染和各种医院内感染。可产多种色素：绿脓素、荧光素（即青脓素）、红脓素、黑脓素,假单胞菌属各种菌产生的色素,3假单胞菌属鉴定程序：,第二部分 铜绿假单胞菌,1.PA培养特性：专性需氧、营养要求不高最适温度35，42 生长，4不生长产生荧光素和蓝绿色水溶性的绿脓素，培 养物呈蓝绿色，故俗称“绿脓杆菌”。培养物有生姜气味,2.PA菌落特征:典型菌落：扁平湿润，边缘不规则，菌落和培养基灰绿色，表面有金属光泽大肠型菌落：菌落圆形凸起，似大肠杆菌黏液型菌落：菌落凸起，呈粘液状侏儒型菌落：细小，无光泽粗糙型菌落：菌落中央凸起、边缘扁平、表面粗糙,典型型（普通平板）,产绿脓素琼脂染成黄绿色,典型型（麦康凯平板）,菌落呈灰绿色 大小不一 扁平湿润 边缘不规则呈伞状伸展 表面常可见金属光泽,大肠型（麦康凯平板）,菌落圆形凸起似大肠埃希菌菌落,粘液型（普通平板）,粘液型（血平板）,菌落光滑凸起成粘液状,侏儒型（麦康凯平板）,细小，无光泽半透明菌落,粗糙型（麦康凯平板）,菌落中央凸起边缘扁平表面粗糙,3.PA抗原结构和抵抗力抗原结构 O抗原 外膜蛋白-保护性抗原 脂多糖-型特异性 H抗原 血清学分型 抵抗力 抵抗力强 耐干燥 不耐热 多重耐药 在室温水中长期生存 4不生长,4.PA临床意义：广泛存在环境中的条件致病菌，是院内感染 主要病原菌 可引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染、囊性纤维变性、心内膜炎等 有多种毒力因子：包括菌毛、荚膜多糖、内 毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶、磷脂酶等 粘附素：菌毛的神经氨酸酶分解上皮细胞表面的神经氨酸促进细菌侵入 荚膜：多糖类物质抗吞噬细胞的吞噬作用；使细菌锚泊在细胞表面，与呼吸道感染有关,绿脓菌素：绿色色素，由铜绿假单胞菌的RpoS基因编码产生的代谢产物，具有氧化还原活性的化合物，能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒氧基团，引起组织损伤。在致病中起重要作用 弹性蛋白酶：降解弹性蛋白，引起肺实质损伤和出血；降解补体和白细胞蛋白酶抑制物；可与相应抗体形成复合物，沉积于感染组织中 磷脂酶C：能分解脂质、卵磷脂，损伤组织细胞 内毒素、外毒素,5.PA生化反应 氧化酶 O/F：O（氧化分解葡萄糖）枸櫞酸盐利用 精氨酸双水解 乙酰胺酶 明胶液化,6.PA临床检验：1采集标本：各种临床标本 医疗器械 环境用品2检验方法：直接镜检 分离培养(血平、MAC平板)鉴定 分型：血清学分型 质粒指纹图谱分型 脉冲场凝胶电泳分型等,3分离培养：普平 18-24h圆形 大小不一 边缘不整 扁平 湿润 常呈融合态 琼脂被染成绿或黄 绿色 血平 扁平 湿润 有金属光泽 琼脂被染成 蓝绿或灰绿 有溶血环 MAC平 微小无光泽半透明 48h后菌落呈 棕色,4鉴定：初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条,PA鉴定程序,非发酵菌鉴定系统,7.铜绿假单胞菌耐药性：多重耐药，能天然抵抗多种抗生素。比如氨苄青霉素、磺胺甲噁唑等。常用三代头孢和氨基糖苷类联合治疗。各种抗生素治疗过程中（铜绿假单胞菌所致感染）都可能发生耐药。初代敏感菌株在治疗34天后可能发生耐药，有必要重复分离菌株。,多重耐药（Multi-drug-resistance，MDR):又称多药耐药，它是指对三类或者三类以上的抗生素耐药的现象。但细菌天然抵抗的抗生素除外。泛耐药（Pan-drug-resistance，PDR):它是指对所有抗生素（除多粘菌素外）耐药的现象。临床上以假单胞菌属、不动杆菌属、窄食单胞菌属等常见。新的超广谱内酰胺酶和碳青酶烯酶的大量使用导致泛耐药 现象增多。,第三部分 细菌常见耐药机制,药物作用靶位的改变,抗菌药物的渗透障碍,药物的主动转运系统,药物灭活酶的产生,细菌常见耐药机制,转座子和整合子介导的耐药基因盒转移和水平传播,1.药物作用靶位的改变,青霉素结合蛋白（penicilin binding protein,PBP）位点：目前研究最多的药物结合靶位，它是内酰胺类抗生素结合位点。正常情况下，某种抗生素与其相应PBP结合，抑制细菌细胞壁生物合成，引起细菌死亡。但是，如果其相应PBP发生改变，抗生素不能与其位点结合，导致耐药。,DNA解旋酶,菌体DNA断裂,菌体DNA,拓扑异构酶,菌体死亡,喹诺酮类-DNA-拓扑异构酶三元复合物,喹诺酮类药物,解链,菌体DNA复制叉不能正常复制,DNA解旋酶和拓扑异构酶位点：它是喹诺酮类药物结合靶位。,2.抗菌药物的渗透障碍,菌体外膜抗生素通道蛋白(Opr)的缺失或者表达量减少：导致抗生素不能进入菌体或者进入菌体的药物剂量少，从而导致细菌的耐药。PA外膜蛋白中的OprC、OprD、OprE是小分子亲水性抗生素进入细菌的通道。OprD又分为OprD1、OprD2、OprD3三种，其中OprD2孔道是小分子碳青酶烯类（美罗培南除外）选择性快速进入菌体的特异性通道。如果oprD2基因缺失或者表达减少，引起OprD2蛋白缺失或者表达减少，导致亚胺培南渗透障碍。,细菌生物薄膜的形成：细菌分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等将菌体包绕成膜样物。物理阻挡作用：逃避宿主免疫清除和抗菌药物的杀伤。耐药基因的开启：生物膜在较低血药浓度下开启耐药基因表达形成细菌耐药。,3.细菌药物主动转运系统,主 动 外 排 泵,质子驱动力系统,ATP偶联盒膜转运系统,小多药耐药蛋白家族,耐药结节细胞分化家族,主要易化超家族,（Small Multidug Resistance，SMR）,（Resistance Nodulation-cell Division,RND）：PA,（Majior Facilitator Superfamily,MFS）,MexVW-OprM,MexGHI-OpmD,MexJK-OprM,MexXY-OprM,MexEF-OprN,MexCD-OprJ,MexAB-OprM,主动外排泵分类：,4.药物灭活酶的产生,药 物 灭 活 酶,钝化酶,修饰酶,水解酶,：如氨基糖苷类钝化酶。,：如氨基糖苷类修饰酶，主要有N-乙酰转移酶（AAC）、O-核苷转移酶（ANT）等，它主要通过共价修饰的方式使氨基糖苷类药物与核糖体的结合减少，促进药物摄取EDP-被阻断，从而导致耐药。aac(6)-基因主要决定庆大霉素耐药；ant(2)-可使庆大霉素和妥布霉素修饰失活。,：主要指内酰胺酶，它包括广谱酶、超广谱酶、金属酶（MBL）和AmpC酶等。,Bush-内酰胺酶分类：根据生化特征或氨基酸序列的同源性，将其分为四类：第一类为头孢菌素水解酶（Amp-C酶），产生菌主要是革兰阴性菌，如假单胞菌、肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。第二类为青霉素酶和超广谱酶，包括革兰阳性菌的青霉素酶，质粒介导的TEM和SHV酶及其衍生物组成的超广谱-内酰胺酶（ESBLs）、羧苄青霉素酶、苯唑西林酶（OXA酶）和由沙雷菌属与肠杆菌属产生的非金属碳青霉烯酶。,第三类：金属酶，由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生的可水解碳青霉烯类抗生素的金属酶。第四类：其他不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶,Ambler分类：根据-内酰胺酶的特殊性、动力学参数及其基因的核苷酸序列，将酶分为A、B、C、D四类：A：青霉素酶，活性部位为丝氨酸残基，由多种质粒编码。如TEM1、SHV1、ROB1或PC1酶。B：金属酶(metalloenzymes)，活性部位为半胱氨酸残基。主要为碳青霉烯酶，耐药的抗生素包括碳青霉烯类、青霉素、第一、二、三代头孢菌素、氨曲南。,C：头孢菌素酶(AmpC 酶)，活性部位为丝氨酸残基，由染色体上一组Amp基因介导，它的产生与-酶诱导剂有关，归因于调控基因突变。D：主要为苯唑西林酶（OXA），可水解苯唑西林、氯唑西林等。,NDM-1：型新德里金属-内酰胺酶(New Delhi Metallo-lactamase 1),其基因bla NDM-1片段475bp。2008年 印度裔瑞典尿路感染患者 尿液 肺炎克雷伯菌粪便 大肠埃希菌 对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感。主要感染类型：泌尿道感染、伤口感染、医院获得性肺炎、呼吸机相关肺炎、血流感染、导管相关感染等。表型筛选和确诊试验：亚胺培南(美罗培南)+EDTA。,5.转座子和整合子介导的耐药基因盒转移和水平传 播,转座子（transposon）又称转座元件、跳跃基因。是在基因组中可移动的DNA序列，它不以独立的形式存在（如质粒或噬菌体DNA等），而在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。转座子可位于质粒或染色体上。细菌转座子Tn1、Tn2、Tn3等可携带内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、16SrRNA 甲基化酶等基因导致细菌耐药。,整合子（integron,int）一种介导耐药基因水平传播的可移动基因元件，它通过位点特异性重组捕获外源基因盒并使之表达。一个整合子可捕获一个或多个耐药基因盒，组成多药耐药整合子，从而介导细菌的耐药性。整合子本身不能转移，但它能插入到转座子或接合性质粒中来传播其携带的重组耐药基因盒，导致耐药基因的播散。整合子主要分为三类：、类。以类为主。,类 整合子结构,5保守末端(conserved segment，CS),3保守末端(conserved segment，CS),可变区（variable region）,磺胺耐药基因(sulI),attC,结构基因（多为耐药基因盒resistance cassettes）,编码整合酶的基因intI-1,整合子可变区启动子Pant,基因重组位点attI,功能不明的ORF5,季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacE1),谢谢！祝大家生活愉快！,
