重大技术装备研制和重大产业技术开发专项.doc

重大技术装备研制和重大产业技术开发专项项目资金申请报告项 目 名 称：生物农药高毒力菌株筛选及产业化技术研究项目申报单位：福建省农业科学院生物技术研究所（盖章）项目负责人：蓝江林 博士、 林营志 博士联 系 人：蓝江林 电 话：13860676510、87848933项目主持单位：福建省农业科学院福 建 省 发 展 改 革 委 员 会 二五年十一月1目 录一、项目概要 1二、研制开发的目的和意义 2三、国内外相关技术发展概况和趋势 6四、前期研制开发情况 12五、主要研制开发内容和考核目标 16六、项目组织实施方案 21七、项目承担单位简介. 32八、技术经济分析和社会经济效益分析 35九、项目资金预算安排、资金来源与落实情况与申请预算内资金的理由 37十、环境影响评价. 39十一、项目申报单位签章 40十二、项目主持单位审核并盖章 40ii一、 项目概要项目名称生物农药高毒力菌株筛选利用与菌种资源基因库的建设。项目建设单位福建省农业科学院生物技术研究所。项目建设内容生物农药行业菌种基因资源库以具备用于生物农药前景的微生物菌种资源收集、整理、安全保藏、共享和利用为主要目标，通过田间采集、分离、诱变等方式收集整理用于生产生物农药的微生物菌种；通过分子标记和脂肪酸结合传统方法鉴定菌株的分类地位；并采用冷冻干燥、低温冷冻和冷藏等方法对菌株进行良好安全的保藏；建立一个计算机信息管理管理系统对菌种的收集、保藏、筛选和产业化应用前期研究进行全程管理；建立系统规范的研究体系确定菌株的潜在价值，并对初筛后认为有前途的菌株进行前期培养条件研究，并从中筛选克隆具备生物农药应用前景的基因，作为高毒力生物杀虫剂和生物杀菌剂的生产工程菌株，成为华东地区最大的生物农药微生物资源收集、保存、鉴定、利用中心，为我省生物农药产业发展提供菌种资源可持续的保障。菌种基因资源库建成后将不断收集整理生物农药菌种资源，通过转让形式向我省乃至国内外生产企业和研究机构提供优质菌株，促进生物农药资源的高效共享和持续利用，在菌株及其专利基因的转让过程中创造社会效益和经济效益。项目经费预算项目预算投资350万元。用于生物农药高毒力菌株筛选与菌种资源基因库的建设。Ø 申请省预算内资金150万元。Ø 承担单位自筹资金200万元。第40页二、 研制开发的目的和意义1. 项目建设背景所谓农药，即凡是用来保护和提高农、林、牧、渔业生产，以及用于环境卫生的药剂，可分为化学农药和生物农药两大类。生物农药是指利用活的有益的菌体、病毒颗粒或微生物的代谢产物，以防治农林病、虫草害和卫生病虫害的药剂。生物农药与化学农药相比，它有以下优点：（1）与传统农药比，生物农药具有更低的哺乳毒性。（2）传统杀虫剂具有广谱活性，而生物农药仅对靶标害虫有效，不会对有机体如鸟类和昆虫以及哺乳动物造成危害影响。（3）生物农药用量少，分散快，可以避免环境污染。随着社会的进步和科技的发展，人们已意识到农业生产过程中施用化学农药和化学肥料造成的危害及其严重程度，它污染环境、致使农产品质量下降，危及食品安全、影响人体健康。食品安全、人体健康、环境保护已成为举世瞩目的大问题，控制全球化合物生物积聚的呼声越来越强烈，欧洲经济委员会正在就取缔目前使用的15种化合物进行谈判，新制定的法规（1996年的食品质量管理条例，劳动者保护标准，农药再登记规定）限制化学农药的使用。我国政府已将食品安全和农副产品的无公害化生产加工技术列入重要的议事日程，制定了一系列加强食品安全、保障人体健康、实施环境保护政策和措施。要求实施无公害农业，大力发展生物农药和生物肥料，减少化学农药和化学肥料使用量，采取切实可行的措施和办法，调整农产品结构，大力发展绿色食品和有机食品生产，向市场提供更多更好的绿色食品和有机食品，以满足人们的需求。加入WTO后，农产品国际贸易的市场壁垒（关税壁垒）已经打破，“绿色壁垒”、“技术壁垒”高筑，对农产品质量提出新的要求，区域性市场保护能力越来越低，农产品贸易的准入是以价格和质量为前提，农产品质量实际上反映了各国科学技术的实力，WTO成员国都在提高农产品检测的质量标准，在公平竞争原则下，设置国际贸易的门槛。目前许多国家已宣布，没有绿色产品或绿色环境标志商品的出口在数量上和价格上受到限制，无公害技术已成为世界农产品贸易的关键，加强无公害化农业的实施，降低农产品的农药残留量，提高农产品质量，是农产品参与国际竞争的基础。微生物农药将为我国绿色农产品保驾护航，冲破“绿色壁垒”，使之在竞争激烈的国际市场占有一席之地。绿色食品和有机食品生产的关键技术是依赖于高防效、无公害、无残留的生物农药及其生化农药的研制和应用。生物农药的研制和应用是发展无公害农业的基础，是发展绿色食品和有机食品的技术保障，已成为世界各国研究的重点。为此各国政府投入大量的人力、物力、财力开展生物农药的研制和应用工作。从农业部1999年统计资料看，我国生物农药（包括生物杀虫剂、生物杀菌剂等）产量占农药总产量不足10%，生物杀虫剂的使用量占杀虫剂总用量不足1.8%，与1992年国际环发大会决议提出的2000年达到60%的要求相距甚远。目前我国生物农药菌种研究处于国际同等水平，但生物农药产业化的工艺研究较为落后，进行生物农药工程技术开发的单位不多，生物农药研发和应用水平低。生物农药技术和生物农药产品是我国今后研究开发的重点。2. 建设必要性分析(1) 生物农药是发展现代健康农业的重要基础生物农药研发是食品安全、人体健康、环境保护的需要。进入21世纪，食品安全、人体健康、环境保护成为举世瞩目的大问题，国际市场上“绿色壁垒”高筑，对农产品品质提出新的要求。我国政府已将食品安全和农副产品的无公害生产加工技术列入重要的议事日程。福建省政府高度重视“餐桌污染”问题，并提出了一系列解决办法和措施。化学农药残留对环境和人类健康构成严重威胁的问题，已到了非解决不可的地步。解决“餐桌污染”问题，实施农副产品无公害化生产，应从低毒、无残留的新型农药入手。因此，生物农药是我国今后农药发展的重点。生物农药研发是发展绿色食品和有机食品的需要。随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对绿色食品和有机食品的需求量越来越大。绿色食品和有机食品生产的关键技术，是依赖于高防效、无公害、无残留的生物农药及其生化农药的研制和应用。生物农药的研制和应用是发展无公害农业的基础，是发展绿色食品和有机食品的技术保障，已成为世界各国研究的重点。生物农药研发是发展农产品国际贸易的需要。加入WTO后，农产品国际贸易的市场壁垒已经打破，“绿色壁垒”、“技术壁垒”高筑，在国际贸易中对农产品品质提出新的要求。各国在同一市场条件下公平竞争，无公害技术成为世界农产品贸易的关键。加强无公害农业的实施，降低农产品的农药残留量，提高农产品质量，是农产品参与国际竞争的基础。(2) 生物农药菌种资源的是生物农药的研发基础生物农药菌种保存即是指为满足生物农药研究及其产业化需要，保存相关菌种基因资源，包括生物农药菌种资源收集、保存、评估及利用，是一项跨学科课题的重要基础工程，涉及到分类学、遗传学、分子生物学、生物工程等不同领域，需众多专家学者共同参与，成立专门机构，长期开展工作。生物农药的研发无一不是从菌种资源出发开始研究，因此，出发菌株资源在很大程度上影响着生物农药研发的进度和研究效果。菌株的匮乏对研发产生严重的束缚作用，长期来，行业内各部门各自为战，大量的菌种采集和保存工作占用了生物农药研发的大量人力和物力。生物农药微生物菌种资源的搜集、保存、评估及利用是未来生物农药研发的重要基础，目前世界上许多国家都把品种资源作为开发生防农药的基础来抓。发展中国家如印度、泰国等投人大量资金来进行本国微生物菌种资源的调查与鉴定，而发达国家如日本、美国等则在全球范围内搜集土样、虫样，然后再把开发出的产品推销到样品来源国。生物农药行业菌种资源的丰富程度对该行业发展起着至关重要的作用，菌种资源是生物农药创新研发的核心基础之一。(3) 生物农药行业菌种资源库的建立可有力促进生物农药的发展我国生物农药研发与应用的要求相距甚远。这和生物农药的实际使用效果尚不能满足要求是分不开的，可利用菌株的欠缺就是其中的一个重要原因。我省地处亚热带地区，气候高温多湿，微生物种类繁多，菌种资源极为丰富。为了开发利用微生物资源，促进生物农药研究，有必要在福建建立生物农药研发相关微生物的菌种库和基因库。建设生物农药行业菌种基因资源库，也是生物农药商业化的重要一环，无论是专利的认证，还是菌种资源的转让，都离不开菌种基因资源库的中介参与作用。更重要的是，通过生物农药行业菌种基因资源库及其筛选评价体系和菌株应用前期研究平台技术的建设，通过对生物农药来源菌株进行广泛的收集、鉴定、保存和利用研究，可大大促进生防菌株的资源共享，借助丰富的微生物种质资源选育出对生物农药产业有重大效益的优良菌种，提升我国生物农药研发水平，推动我国绿色农业乃至有机农业的迅速发展。三、 国内外相关技术发展概况和趋势(1) 生物农药的主要发展及其国内外市场状况生物防治与化学防治相比，具有安全、持久、效果好、成本低的特点，基本上可归纳为三大技术体系：传统生物防治、本地天敌的自然保护与利用、微生物农药的产品化。随着生物防治的推广应用，微生物农药研究与生产逐步成为生物防治的支柱产业。尽管生物农药在我国具有较悠久的历史，在国际上享有较高的声誉，但我国生物农药的研究、开发、生产和应用都还存在着许多突出的问题和困难，研究开发的基础性工作并不扎实，产品的作用机理、毒理学、残留和环境等行为的研究仍不深入、不全面。 由于微生物农药具有许多优点，因而引起许多国家的重视，投入大量人力和物力进行开发和研究。在微生物农药迅速发展的过程中，全球性大型化学农药公司和生物技术公司也纷纷投以巨资发展微生物农药。生物农药的国内外市场状况为：Ø 国际市场1992年“世界环境与发展大会”的第21条决议指出“要在全球范围内控制化学农药的销售和使用，到2000年生物农药的产量将占农药总量的60%”。在微生物农药迅速发展的过程中，国际上新型生物技术公司，如：Mycogen公司、Ecogen公司等应运而生，全球性大型化学农药公司和生物技术公司，如：美国的杜邦公司和孟山都公司、德国的拜耳公司、瑞士的汽巴嘉基公司、丹麦的Novo公司、日本的住友公司等也纷纷投以巨资发展微生物农药。据美国环保局统计，上世纪80年代初，苏云金芽孢杆菌杀虫剂的销售额仅50006000万美元，预计本世纪初可达80亿美元。随着经济的不断增长，人们对生存质量要求的提高和环保意识的增强，社会要求农业部门生产出更多更好的绿色食品和有机食品，而农产品无害化生产是以发展生物农药为基础的，可以预见，生物农药的需求量将呈现大幅度增长趋势。Ø 国内市场我国已将发展生物农药和绿色食品列入中国21世纪议程。我国是农业大国，农药需求量大，目前我国农药的使用总量达150万吨制剂，其中生物农药仅占1.8%。从省内市场看，生物农药仅从现在的1.5%上升到10%（国外为60%），全省生物农药需求将达3400吨/年（全省农药使用总量40000吨/年），销售额约1.7亿元/年。全国生物农药的需求量按同一比例将达102000吨/年，年销售额50亿/年左右，为满足人们提高生活质量的要求和应对国际贸易的需要，今后我国将大力发展无公害农产品，向国内外市场提供量足质优的绿色食品和有机食品，因此必须进一步调整农药使用结构，减少化学农药的使用，增加使用生物农药，生物农药市场前景十分广阔，成为我国今后发展的重点。(2) 生防农药的研发热点Ø 菌种资源收集、鉴定与保存目前世界上许多国家都把品种资源作为开发生物农药的基础来抓。发展中国家如印度、泰国等投人大量资金进行本国微生物菌种资源的调查与鉴定；而发达国家如日本、美国则在全球范围内搜集土样、虫样，进行菌种资源的调查和鉴定，再此基础上研发出新型产品，推销回样品来源国。Ø 菌种的基因工程改造 目前主要有两种方法：一种是把Bt经过改造，使之能与另一种根际微生物融合，这样，就可使喷洒的Bt制剂在植物根部附近大量增殖，从而使植物不受虫害威胁，尽管Bt对绝大多数生物无毒无害，但它对养蚕业是一个威胁，而转基因微生物对环境的危险性评估也较为复杂；另一种方法是把Bt进行改造，使生产出来的毒蛋白晶体能进人另一无任何毒副作用的杆状菌体内，这不仅可防止Bt的毒性外泄，又可以大大延长药效。Ø 抗虫抗病基因克隆用于生物农药的微生物之所以能抗虫抗病，主要是由于其在代谢过程中的产物对有害生物有选择性杀伤作用。克隆代谢产物相关基因，并转入作物种，可提高作物的抗虫抗病能力。目前，转Bt毒素基因的抗虫棉已在大田中使用，效果良好。(3) 生物农药菌种资源的主要种类可用作生防农药的微生物种类非常丰富，进行深人研究的主要有如下几大类：Ø 芽孢杆菌类目前Bt苏云金杆菌类已发现30多个亚种，大部分已能投人工业化生产，主要用于防治农林害虫，近年来在防治蚊虫方面的研究也引起了重视。BS球形芽孢杆菌类也已发现十几个亚种，主要用于防治蚊蝇等卫生害虫，部分已小规模投产。Ø 病毒类NPV(核型多角体病毒)类专一性性较强 目前已发现几百种，在国外投人应用的有l0种左右，在我国实现工业化生产的只有棉铃虫NPV病毒杀虫剂，这个项目的开发已列入我国的“火炬计划。CPV(质型多角体病素)类全世界共发现几十种，在美国、日本已经开发。包涵体病毒目前已发现几十种，部分已在美国注册。Ø 真菌类目前研究最多的真菌是白僵菌和绿僵菌。目前在林业虫害防治中起着重要作用，已成为重要中国南方林区的重要常规手段之一。(4) 菌种基因资源库的建设现状微生物资源可以包括其菌种、遗传和代谢产物及其生态组成，与动物、植物资源相比，又具有多样性、易变性、生长快等特征。生命科学研究、预防医学的研究、生物技术及其产业的研发、食品科学的研发等都是建立在微生物资源基础之上，生物农药的研究也不例外。鉴于微生物菌种资源的重要性，国内外相继建立了众多的微生物资源保藏库。Ø 国外微生物资源保藏库国外发达国家微生物菌毒种资源库建立的很早，有的已达近100年历史。发达国家的菌种保藏中心具有相对的独立性和相当强的研究力量及研发部门，除了稳定的资金支持外，还有一支基础较好的研究队伍，共享和管理机制健全。储藏的微生物资源较丰富，而且信息量大，不但可提供微生物资源，很多还可提供技术服务。国际菌种保藏联合会(WFCC)由62个国家的464个菌种保藏管理机构组成。此外，目前国际确认的专利培养物保藏机构(IDA)有28个。表2-1 国外典型培养物保藏机构Ø 我国微生物资源保藏库我国微生物资源库，虽然有的建立也较早，但由于资金和管理机制等问题，发展一度缓慢，目前国家积极加大资金投入，很多领域的微生物保藏库开始发展壮大，资源品种、数量和信息量开始加速提高，并开始实现共享。目前主要有以下微生物资源库(见表2)。中国微生物界最大的菌种保藏组织是中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM)，其下属中国科学院微生物研究所、中国科学院武汉病毒研究所、中国农业科学院土壤肥料研究所、轻工业部食品发酵工业科学研究所、中国医学科学院皮肤病研究所、卫生部药品生物制品检定所、中国医学科学院病毒研究所、中国医学科学院抗菌素研究所、四川抗菌素工业研究所、华北制药厂抗菌素研究所、农业部兽医药品监察所、中国林业科学院林业研究所，目前已经联合建立了我国第一个统一数据结构的国家级菌种保藏数据库中国微生物菌种目录数据库，它适合我国微生物学界、医学界的科研人员在寻找微生物菌种时使用，该库可在网上进行查询。BCRC (Bioresources Collection and Research Center)台湾生物资源保存及研究中心(食品工业发展研究所)。BCRC主要从事农业、应用微生物、细胞生物技术、基因工程、菌种保藏方法、工业微生物、食品科学、发酵、分子生物学等方面的研究。该保藏中心保存有细菌4541株，真菌3069株，酵母1564株，质粒451株，动物细胞356株，植物细胞20株，细菌病毒180株，重组DNA宿主217株。菌种保藏方法主要采用冷冻干燥保藏、冷冻保藏、液氮保藏、移接保藏、硅胶保藏等。该中心保藏的菌种可出售。表2-2 我国主要的菌种资源库列表1. 发展趋势预测(1) 食品和健康的需求将有力推进生物农药的研发可以预见，随着社会的进步和科技的发展，以及人们对生存质量要求的提高，环保意识的增强，社会要求农业生产部门提供更多更好的绿色食品和有机食品，而农产品无害化又是以发展生物农药为基础。市场需求量扩大是生物农药发展的动力，可以相信在各国政府的重视和科学家的努力下，今后生物农药技术的应用领域将进一步扩大，其技术的水平将得到进一步提高，生物农药的品种将越来越多的被开发出来。生物农药将成为一个重要的高技术产业，成为保障食品安全、人体健康、环境保护的重要技术后盾，也将成为竞争非常激烈的产业之一。激烈的市场竞争，必将推动生物农药的研发水平的提高。今后将有更多品种、药效更好、价格更低、安全性更高的生物农药涌现出来，供应市场。生防农药一方面朝着发酵法工业化大生产方向发展，另一方面努力将其有效相关基因克隆到植物体内以培育出抗病虫害的植物。在不久的将来，二者在产业市场上将形成相抗衡的局面。而且在短期内，无论哪一方想取代对方都是很困难的。这或许对于经济的发展更为有利。(2) 特色菌种基因资源库日益成为生物相关产业发展的重要基础我国是世界上十个生物多样性大国之一，生物物种极为丰富。面对二十一世纪经济发展的机遇和挑战，以现代生物技术为基础的生物资源开发是我国未来全球生物资源竞争的一个战略重点。具有行业特色的生物资源的共享和开发是其中极为重要的环节。2004年12月2425日，由中国农科院召开的自然科技资源平台共享建设微生物菌种资源描述标准和规范研究制定及共享试点建设和微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程项目专家评议会在北京召开。这次会议对项目组编制的18个微生物菌种描述规范和11个微生物菌种资源收集、整理、保藏技术规程进行了评议。各行业都在努力建立具有行业特色的微生物资源菌种库。南京农业大学农业建立了环境微生物种质资源库，筛选到高效安全降解菌株20多株，菌株性能优越，农药残留降解率高达在95-99.8%，而且菌株本身无毒、无害、无二次污染。2005年6月6日，茅台集团隆重宣布，茅台酒曲太空诱变育种研究取得阶段性成果，科技工作者已从茅台酒曲中成功分离，鉴定出过去未知的100多种1200多株菌种，并在此基础上建立了我国白酒行业首家酿造微生物资源菌种库。目前,尚未见到专门用于服务生物农药研发用的生物农药微生物资源基因库的建设的报道。四、 前期研制开发情况1. 本项目前期准备(1) 菌种采集、鉴定和保存以具备了一定基础在近年来的相关项目研究中，菌种的采集和保存都是重要的一个环节。相关研究的重要突破首先就出现在大量菌株的采集中。为了加快菌株的识别，我们研究并掌握了多种微生物菌种的分类鉴定方法；为了有效保护分离采集的菌种资源，我们研究并掌握了甘油冷冻保存等微生物保存方法，目前的项目组的菌种库中已拥有了超过800个菌株，涵盖细菌、放线菌和真菌，不仅包括生防菌株，也包括大量病原微生物。在这些菌株的收集、鉴定、保存中积累丰富的经验，为本项目中菌种基因资源库的建立打下了坚实的基础。(2) 已建立了针对部分病虫害的生物农药菌株筛选评价体系近年来开展的项目中，最终选用的生防菌株就是从大量采集的菌株中通过一个标准化的筛选过程中获得的，在Bt9408和ANTI-8098A的筛选过程，我们积累了较多的经验，建立了一系列标准化操作规程（SOP）。这些工作的基础为项目中筛选评价体系的建立提供了可参照的规范。(3) 已建立了部分候选生防菌株产业化前期研究体系在近期研究项目中，Bt9408和ANTI-8098A的最终走向应用，离不开相关的应用前期研究，在这些研究过程，我们建立了部分前期研究体系的标准化操作程序。本项目中该部分的研究拟从这些操作规范出发进行展开。2. 近年来相关研究成果本项目组所在单位近年来在生物农药领域取得了众多研究成果，微生物农药BtA研究已通过专家鉴定，专家认为：该研究所采用的6个技术单元大部分属本领域的创新技术，为微生物农药的研究开辟了一条新途径。微生物农药BtA的整体研究达到国际先进水平，藕合技术达到国际领先水平，奠定了我省微生物农药工艺研究的基础；微生物杀菌剂ANTI-8098A被列为省科技重点项目；微生物杀线虫剂Boduan-0625研究已取得重大突破，使线虫生防菌离体培养成为可能；生物除草剂的研究进入了科研贮备阶段；微生物杀蚜剂Homo-9911作为我国支援古巴的项目，突破了该生防制剂液体发酵的工业化生产技术。具体如下：(1) 高效生物杀虫剂BtA该中心高效生物杀虫剂BtA的研制与应用已取得巨大的成功。从1996年以来，高效生物杀虫剂BtA在我省茶叶、蔬菜、果树、水稻上累计推广示范面积达400多万亩次，可以防治五个目近58种农业害虫。(2) 青枯病生物杀菌剂ANTI-8098A福建省重大农业项目青枯病生物杀菌剂ANTI-8098A的研制与应用和青枯病生防菌ANIT-8098A抑菌机理试验室建设(20002005)：研究中，由福建省科技厅和福建省计委投资130万元，本研究筛选到青枯病生防菌株ANTI-8098A，经德国菌种保存中心(DSMZ)鉴定为蜡状芽孢杆菌，发现生防菌的对青枯菌的致弱作用，对生防菌的微生物学、发酵技术、生产工艺、质量标准进行了系统研究，生产出生物杀菌剂-安地，经农业部药检所农药田间药效测定对茄科青枯病的防效在7585%。目前生物杀菌剂ANTI-8098A的开发前景也很好，该项目作为省农科院科技兴农重点下乡项目，在我省福州(茄子等)、莆田(辣椒等)、漳州(西红柿等)、厦门(西瓜等)、三明(烟草等)、龙岩(烟草等)等地防治青枯病，使用面积达2000亩。平均防效达7085%，挽回经济损失40多万元。(3) 枯萎病生物杀菌剂BS-2000瓜类枯萎病是瓜类作物的一种顽固的毁灭性的土传病害，能使植物减产30100%，由于其病原菌尖孢镰刀菌具有很强的腐生能力，在土壤和植物残株中能以厚坦孢子、分生孢子等存活56年以上，目前一旦发病几乎无药可治。目前化学防治是控制该病害的重要手段之，但因该病属维管束病害，病原菌又为土壤习居菌，因而药剂防治十分困难。目前大多只限于土壤处理与种子消毒，对大田罹病植株尚缺乏有效的内吸治疗剂，多菌灵等苯并咪唑类内吸杀菌剂曾有报道用于防治枯萎病，它们对枯萎病菌的室内抑菌效果是肯定的，但应用于大田却存在着内吸困难、成本高、防病治病效果不佳的问题，如每亩使用成本在1520元之间，而且效果较差，平均防效在4060%之间，且易对环境造成污染。同时，枯萎病是土传病害，对化学杀菌剂的抗性能力因土壤的保护变得很强，发病后，用多菌灵难以达到防治效果。福建省农科院生物技术研究所从2000年开始对枯萎病生防菌进行系统的研究，从大量的生防菌筛选中，选择出一株对枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌有很强的抑制作用的芽孢杆菌和二株协生芽孢杆菌，经对其生物学特性、生理、生化测定的结果表明枯萎病生防菌为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)，二株协生菌为巨大芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌。并对三种芽孢杆菌的培养技术、抑菌机理、生产工艺、存活基质等进行初步的研究，发现了不同的营养物质、C/N比、通气量、温度可以使微生物生防效价提高明显，通过发酵技术的研究使得生防菌发酵菌量增加510倍不等。(4) 生物杀线虫剂线枯宁和维线克植物线虫病是腔肠动物线虫引起的一类根部病害。目前，植物线虫病发生日益严重，几乎所有的作物都有线虫危害。被线虫危害的作物，根部变形，严重影响作物的根部吸收，造成植株强化，营养不良，致使全株死亡，严重影响作物产量。全国农作物种植业每年因线虫造成的危害损失近233亿元，仅我省闽南金三角主要经济作物和蔬菜年均损失达1亿元。由于线虫寄生于植物根部，处于土壤的缓冲体系中，几乎没有化学农药能有效地防治线虫，虽然某些化学农药如二溴氯丙烷对线虫有一点防效，但却造成了严重的环境污染，引起男性不育，食物中毒，已被国家停止生产和使用。线虫的生物防治引起了学者的注意，国内外学者在线虫上发现了一个寄生菌穿刺巴氏柄菌(Pasteuria penetrans)，它可以寄生于根结线虫(Meloidogyne spp.)，短体线虫 Pratylenchus spp.)，穿孔线虫(Radophoius spp.)，螺旋线虫 (Aphelencholdes spp.)，矮化线虫(Tylenchorhychus spp.)，滑刃线虫(Aphelenchoides spp.)和剑线虫 (Xlphincma spp.)等多种植物线虫，其孢子附在线虫表皮上，并穿过表皮在线虫体繁殖，使线虫不污染、丧失侵染力和繁育能力，由于该线虫寄生菌属专性寄生，寄生率高，防效好，但是，由于专性寄生，无法离体培养，线虫病原的离体培养成为研究的核心。中白科技合作项目生防工程菌的引进改良与生物制剂(杀线剂线枯净)的研究，由福建省科技厅国际合作处资助20万元，引进白俄罗斯线虫生防菌，实现线虫寄生菌离体培养，使生物杀线虫剂的工业化生产成为可能，研制出生物杀线虫剂-线枯净，对蔬菜根结线虫具有良好的抑制作用，能有效地破坏根结线虫卵的孵化，控制根结线虫种群在经济危害水平之下。生物杀线虫剂维线克的研制由福建省农科院和河北省秦皇岛市科技局共同资助10万元，通过芽孢杆菌和放线菌毒素的提取，加工成生物杀线虫剂-维线克，2002年已进入秦皇岛市田间试验，取得良好的结果。生物杀线虫剂的成功，将带来巨大的经济、生态和社会效益。(5) 微生物杀蚜剂Aphid9911近十年来，我国保护的(温室及塑料大棚)蔬菜花卉种植面积迅速扩大，现已超过1000万亩，为保障我国北方地区冬季蔬菜和花卉供应做出了重要贡献。在农业生产可喜发展的同时，温室虫害问题日趋严重，其中温室白粉虱和蚜虫的危害问题特别严重，作物受害面积不断扩大，害虫对化学农药的抗性十分突出。报道显示，上世纪七十年代初，国外首次发现温室白粉虱对常用农药马拉硫磷、DDT、DDV产生抗性，之后，又发现白粉虱对有机氯、有机磷、拟除虫菊酯氨基甲酸等多种化学杀虫药剂产生了强大抗性。我国形势也很严峻，北京地区1988年首次监测到白粉虱对常用化学药剂产生明显抗性。山东地区1986年监测到瓜蚜对化学杀虫剂杀灭菊脂的抗药性，增长了10005000余倍，不仅使农药用量增加和防治成本提高，而且严重污染了人类的食物和生活环境。微生物杀蚜剂Aphid9911是利用真菌蜡蚧轮枝菌菌种，通过生产保种、培养基筛选、液体培养、扩大繁殖、存活基质等技术的研制而成，对蚜虫、粉虱等高抗药性害虫的控制效果达到95100%，特别用于生产冬季蔬菜大棚有较好的防效。五、 主要研制开发内容和考核目标1. 建设规模本项目拟建成华东地区最大的生物农药微生物资源收集、保存、鉴定、利用中心，为我省生物农药产业发展提供保障。通过转让形式向国内外生产企业和研究机构提供优质菌株及相关配套技术，促进生物农药资源的高效共享和持续利用。主要建设规模为：Ø 建立生物农药行业菌种基因资源库的收集保藏系统，年收集保存菌株800株；Ø 建立以脂肪酸、rRNA和传统生理生化方法的细菌鉴定系统，具备年鉴定2000个菌株的能力；Ø 建立一整套针对作物病害、虫害、线虫为害以及杂草的生物农药候选菌株的筛选评价系统，年筛选通量500株；Ø 建立一个候选菌株的产业化前期研究体系，通过该体系，对存在重大潜在应用价值的菌株的生理生化、发酵培养等特性进行基础性研究，使其能够尽快地进入开发阶段，为相关菌株的产业化做好充分的准备，年研究通量100株。Ø 开发专用菌种资源管理信息系统，贯穿菌种资源收集、保存、鉴定、筛选评价和前期研究的全程电子化管理，并通过专用互联网站实现信息的共享，作为生物农药行业菌种资源转让、交换的电子平台。2. 项目建设内容和考核目标(1) 生物农药菌株的收集保藏系统从全国各地收集微生物菌种资源，从丰富的天然资源中筛选含不同基因类型的特异高毒力菌株，创造具有自主知识产权的新农药，使制剂的品种多样化，从而为福建省生物农药技术研发提供基础性技术支持。Ø 生物农药菌株的收集机制建立生物农药菌株的日常采集模式。从全国各地收集微生物菌种资源，包括细菌、真菌、放线菌等，创造具有自主知识产权的新型农用微生物资源。拟采用的收集途径为野外采集、国内外引进交换、实验室诱变育种，基因修饰育种等方式。提供社会使用或作为选育新菌株时的出发菌株；在建立菌种库的同时，建立资源基因库和质粒库。Ø 生物农药菌株的保藏系统在本项目中建立生物农药菌株的硬件设施加以保存，并建立各种保存技术的标准操作规程(SOP)。建立多种菌株保藏机制，据保存菌株的时间和应用选用。拟选择不同的方法进行保存。短期保存选用常规保存法、斜面穿刺等方法，长期的原种保存则采用甘油冷冻保存或者采用冷冻干燥干粉保存。对于特殊的菌株尚需选用的特殊的方法，如青枯雷尔氏菌可选用无菌水常温保存法进行保存。拟采用的保藏方法有：常规保存法、半固体穿刺保存法、普通斜面保存法、砂土管保存法、甘油保护超低温保存法、冷冻真空干燥保存法。(2) 生物农药菌种鉴定系统Ø 基于脂肪酸检测的生物农药菌株鉴定系统本项目的细菌菌种鉴定体系拟采用美国MIDI公司研发并投入市场Sherlock Microbial Identification System (MIS)系统。该系统可用来分析及鉴定在培养基中纯培养的微生物，鉴定结果可获得美国FDA认证许可，目前可系统已大量用于微生物的菌种分类鉴定，目前国内也开始引进，均用于疾病控制中心。该系统的菌种鉴定周期短，速度快，拟用此系统作为菌种初筛种的快速菌种快速鉴定。在此基础上建立生物农药相关菌株的脂肪酸鉴定子系统。需完成如下工作：² 对收集的菌株进行脂肪酸测定按照MIS提供的标准对收集到的菌株进行大量的脂肪酸测定，除获得菌株分类地位外，还可以获得大量的菌株脂肪酸含量信息。这些信息包括脂肪酸的种类和各种类之间的相对含量比例。² 对大量菌株的脂肪酸测定结果进行聚类分析对大量菌株的脂肪酸含量信息进行聚类分析，对不同种类的脂肪酸采取不同的权重，选择不同的算法进行比较，获得菌株的脂肪酸分类树。² 通过聚类分析建立子库依据脂肪酸分类树建立字库。在建立子库时可根据不同的聚类方法建立多种应用于不同模式下的分类库。以适用于不同的应用环境。例如，建立针对鳞翅目害虫的专用生防菌株数据库；或者建立目标病害微生物的专用菌株数据库，如细菌性青枯病的病原菌青枯雷尔氏菌的种下分类子库。Ø 基于rRNA序列差异的生物农药菌株鉴定系统应用脂肪酸鉴定时，偶尔会遇到某些待测菌同时会和数据库中的几种微生物均较为相似。这时就需要辅助其他方法进行菌株的分类地位鉴定。我们拟选用微生物的核酸序列差异性作为菌株鉴定的第二选择。这种方法通常可以达到种的分类水平。本项目拟采用公用16S(18S) rRNA（18S rDNA）、16S-23S（18S-23S）rDNA间隔区序列，通过拼接组装制作一个生物防治相关菌种鉴定专用数据库，建立网站（bacillus.dagri.org）：提供rDNA数据检索功能，提供blast功能，并在此基础上构建一个鉴定系统。Ø 基于传统生理生化方法的菌株鉴定系统细菌传统鉴定法是细菌形态和生理生化水平的鉴定，依据细菌在多种标准培养基上生长的生理生化特性进行分类是最经典、最常用的分类鉴定指标，也是现代化分类鉴定的依据。对于采用上述两种方案仍不能确定的菌株分类，拟采用传统的生理生化方法进行菌株鉴定。(3) 生物农药菌种基因资源库信息管理系统长期以来我国微生物菌种保藏管理的信息化水平低，对于菌种的检索主要是书面形式，这种检索方式的特点是：检索速度慢，难以及时收录新发现的菌种资源，对现有欠妥信息难于及时改动，难以实现生防菌株资源的高效共享并为生物农药研发服务。如何能方便、经济、快捷地获得共享所需的菌种信息，是政府相关部门、科研院所和科研人员最为关切的问题，而解决这些问题的根本途径就是利用数据库信息系统进行菌种资源的信息化管理，并通过互联网对外提供菌种相关信息。本项目拟以生物农药菌种信息为研究对象，采用计算机网络和数据库技术，构建基于Internet的菌种资源数据库管理及查询网站（germ.dagri.org），基于HTML和PHP采用Dreamweaver进行编写。系统的开发不仅能为菌种基因资源库的动态管理提供了方便，还能为有关科研工作及应用开发提供科学准确的资料，促进资源共享，提高研发效率。拟开发信息系统采用程序设计语言结合数据库引擎的方法进行开发。Ø 拟采用的系统构建模式基于Linux系统架构，故此采用PHP进行程序设计，采用PHP+MySQL也是目前B/S应用程序的常用模式。信息数据库放置在internet网站上，用户通过网页浏览器管理并使用该信息库。Ø 系统数据结构和实现方式基于数据库规模和因特网上实现的需要，拟采用MySQL作为数据库引擎，构建数据库；使用Perl脚本制作检索语言，建立基于B/S界面的应用系统。拟将菌种资源数据库设计为由一个若干个数据表通过一定的关系组合而成。Ø 操作界面本系统采用B/S界面，用户的操作界面就是WEB浏览器中浏览的网站，界面形象直观，使用者不需要知道数据库的结构与具体的操作过程，只需选择相应功能，就可以完成所需要的操作。Ø 拟提供的系统服务本信息系统拟提供的服务为：保藏菌种的信息管理、数据的备份、信息检索、查询。(4) 生物农药高毒力菌株筛选评价系统从田间采集所得的菌株并不都可作为生物农药的备选菌株，尚需要经过毒力的筛选，工作量大而繁复，建立高效的高毒力菌株筛选评价系统就显得尤为重要。在此，我们试图建立一种有效的菌株筛选评价系统，可针对不同的病虫害提供不同的评价方案和研究平台，并制作筛选评价方案的标准操作规程(SOP)。菌株筛选是通过比较不同菌株对目标病虫害病原的毒力进行的，测定方法通常选用生物测定法，生物测定的自动化和标准化有助于建立高通量的菌株筛选评价体系。建立有效的菌株筛选评价系统，首先需针对不同的病虫害确定相应的评价指标，培养目标病原并经标准化处理后作为作用靶标；然后按照标准的处理模式将待测菌体或发酵培养产物施用于靶标生物，通过靶标生物的死亡率或抑制率确定待测菌株的毒力。(5) 生物农药菌种产业化应用前期研究体系筛选评价后