发酵工程生物科学.ppt

第四章发 酵 工 程,细胞工程,酶工程,发酵工程,基因工程,发酵工程是一个历史悠久的行业，与人类生活和健康息息相关。日常的发酵产品？发酵工程的定义？,1 发酵工程概论1.1 发酵的概念1.1.1 传统意义上的“发酵”概念 用来描述“酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡”的现象。,1.1.2 生物化学和生理学意义的“发酵”概念,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物，产生能量的一种方式。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2,1.1.3 工业意义上的“发酵”概念泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，包括：（1）厌氧发酵的生产过程，如酒精，乳酸等。（2）好氧（通气）发酵的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。1.1.4 现代“发酵”泛指“利用生物细胞（应用生物技术获得的细胞）生产某种产物的过程又称新型发酵。,发酵工程：亦称（微）生物工程，是大规模发酵生产工艺的总称，就是利用生物细胞的生命活动，通过现代工程技术手段来生产有用物质的技术。,1.2 发酵工程的主要发展阶段1.2.1 天然发酵阶段：传统的酿酒、制酱等。1.2.2 纯培养阶段：人工控制微生物发酵过程（第一个转折点）1.2.3 通气搅拌技术阶段：（第二个转折点）1.2.4 代谢控制发酵技术阶段：（第三个转折点）1.2.5 利用基因工程菌进行发酵阶段：（第四个转折点）,1.3 发酵工程技术的应用1.3.1 医药工业 抗生素、维生素、酶、疫苗、干扰素等1.3.2 食品工业 SCP、氨基酸、饮料、酒类、添加剂等1.3.3 能源工业 纤维素、半纤维素的转化、采油、产氢、沼气的生产等。,1.3.4 化学工业 乙醇、丙酮、生物塑料、表面活性剂等。1.3.5 冶金工业 黄金开采和铜、铀等金属的浸提等。1.3.6 农业、牧业 生物固氮、生物杀虫剂、微生物农药、微生物饲料等。1.3.7 环境保护 有机废物（生活垃圾）的微生物的降解。,以上这些应用可概括为五个方面的内容：1、微生物菌体发酵 2、微生物酶发酵 3、微生物代谢产物发酵 4、微生物的转化发酵 5、生物工程细胞发酵：指“应用生物技术获得的细胞进行培养的新型发酵”（动、植物细胞、杂交瘤细胞等的培养）。这些内容都通过以下两大发酵类型来实现。,在开放或密闭的发酵设备中完成。,发酵技术的特点：速度快；条件人工可控；原料可再生（易得）；产物分子复杂；易染菌；,2 发酵过程及控制2.1 发酵一般过程,生产者,原料,场所,产品,生物细胞,培养基,发酵罐,产品,发酵罐(发酵条件控制),发酵工程的一般过程,2.2 微生物及菌种 微生物广泛地存在于自然界中，与人们生活紧密相关，有的有害，有的有益。如2.2.1 工业生产常用微生物 细菌：醋酸、丙酮、丁醇、乳酸以及氨基酸、酶、维生素、酸菜、酸奶；霉菌：酶制剂（制曲）、制药、饲料；酵母菌：单细胞蛋白、酒精生产（酿酒）、疫苗；,注意：因类、种不同而有不同的生理生化特性。,2.2.1.1 细菌类（1）枯草芽孢杆菌（2）大肠杆菌（3）醋酸杆菌（4）棒状杆菌（5）短杆菌（产氨短杆菌）,球菌,杆菌,2.2.1.2、霉菌类（1）黑曲霉（2）米曲霉（3）青 霉（4）木 霉（5）根 霉（6）毛 霉,黑曲霉的电镜观察图像,黑曲霉平板生长菌落图像,米曲霉电镜观察图像,米曲霉平板培养菌落图,青霉,木霉,根霉,毛霉,毛霉在PDA培养基上的菌落特征,2.2.1.3 放线菌类（1）链霉菌属（2）诺卡氏菌属,链霉菌属,诺卡氏菌,2.2.1.4 酵母类（1）啤酒酵母 第一个完成全基因组序列测定的真核生物（1997）；（2）假丝酵母,酿酒酵母,2.2.2 工业化生产对菌种的要求：(1)能利用廉价原料，产物产率高；(2)条件易掌握和控制；(3)速度快；(4)满足代谢调控要求；(5)抗噬菌体的能力强；(6)优良性能持久、稳定；(7)非病源菌；,获得生产用微生物菌种的一般过程:,原菌种,斜面试管,液体试管或三角瓶,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,接种：可采用菌体或孢子 对于细菌、酵母，常采用菌体接种；对于霉菌、放线菌，常采用孢子接种；包括孢子悬浮液的制备,2.2.3 种子扩大培养过程及控制2.2.3.1 工艺过程,（1）培养基成分A、因孢子和菌丝体不同而异；B、最后一级种子培养基应尽量与发酵培养基一致；C、配比恰当、新鲜；（2）种龄与种量：对数期、1%-10%；（3）培养条件：温度、pH值、溶解氧；（4）泡沫：泡沫影响氧溶解和传递；（5）染菌：染菌影响（纯、壮、量）；（6）种子罐级数：与“菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、罐的容积”有关。,2.3 培养基及其制备生物体主要由：C、H、O、N 四种元素组成。发酵培养基的组成和配比，因微生物种类、设备、工艺、原料来源及质量不同而有所差别碳源：碳源是组成培养基的主要成分之一（菌体干物质的50%以上是碳）。主要功能：细胞、产物的骨架；来源：糖类；,氮源 氮源也是培养基的主要成分之一（占干物质量的10%）。主要功能：细胞、酶产物的组成；来源：有机氮、无机氮；,无机盐及微量元素 主要功能：组成、辅助因子等；来源：盐（原料、水）；特殊生长因子 不可缺、量微，自身不能合成或量不够。主要功能：辅酶，电子受体；来源：水 水是物质溶解和生化反应的基础。功能：,2.4 发酵及控制2.4.1 发酵类型,无论耗氧发酵还是厌氧发酵，都需要在反应器中完成。,比较一下各自的有缺点,2.4.2 生物反应器(Bioreactor)2.4.2.1 发酵罐的基本条件 适宜D/H；承载一定的压力；充分混合(好氧)；密封严，无泄漏；结构要经济；,2.4.2.2 液态厌氧发酵设备 有冷却装置 没有通风装置 代表：（1）酒精发酵罐（2）啤酒发酵罐,2.4.2.3 液态好氧发酵罐 有冷却装置；有通风装置；代表：机械搅拌发酵罐 气体搅拌发酵罐,机械搅拌发酵罐,（2）气体搅拌发酵罐 内循环 外循环,2.4.3 发酵的操作方式,2.4.3.1 间歇发酵法 一次性；不稳定；过程，营养不断减少，微生物不断增殖，环境呈不稳定状态。微生物生长的四个时期明显。应用广泛,分批培养微生物群体的生长,1.延滞期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期,2.4.3.2 连续发酵法 等量流入流出；各种变化0；微生物群体生长的四个时期不完整；常用于废水处理、葡萄糖酸、酒精、氨基酸发酵等工业中；,1,2,3,4,5,6,7,糖化醪+酒母,多级连续发酵系统,连续发酵的优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；易于过程优化；连续发酵的缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；对设备及附件要求高；,2.4.3.3 补料间歇发酵法 在分批培养时，连续地供给培养基到一定程度的方法，称为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。补料间歇发酵的特点：可以解除底物抑制、产物抑制、G分解阻遏或克服微生物过度生长等；,2.4.4 发酵工艺控制,2.4.4.1 温度的控制(1)影响发酵温度的因素 培养基氧化、机械搅拌等产生一定的热量、罐壁散热、水分蒸发带走部分热量。,温度变化具有时间性；,(2)为什么要控制温度：影响产物生成速度 影响发酵液性质 影响产物种类 a.改变酶系中间产物种类产物种类;b.使代谢比例失调；影响产物特性(3)控制方式：冷媒（喷淋、蛇管、夹套）,2.4.4.2 pH的控制（1）控制pH的意义 不同种类微生物，对pH要求不同；同种微生物对pH变化的反应不同。pH不同，微生物代谢产物不同。微生物生长和发酵的最适宜pH可能不同。,(2)引起发酵pH变化的因素 下降培养基中C/N太高，有机酸积累；消沫油加得过多；生理酸性物质过多；上升C/N比例太低，N过多，氨基氮释放；生理碱性物质过多；中间补料时碱性物加入量过大；,（3）控制pH的方法 A、常见方法 调整生理碱性和酸性盐类的比例；选择不同C、N的种类和比例；添加缓冲剂；流加酸或碱；B、应急措施 改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,2.4.4.3 溶解氧,（1）影响氧溶解的因素 温度；微生物需氧量（耗氧速率，本质）；氧溶解的推动力；（2）控制溶解氧的意义（多数发酵产品的生产是好氧发酵；培养基中的氧不足以维持发酵过程；不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对氧的要求也不相同；）节约能量,在发酵工业中，氧主要通过通入无菌空气的方式来供给。通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的大小，最好由氧溶解量的多少来决定。而氧溶解量的多少与多种因素有关。,（3）提高溶解氧的方法 增加氧溶解的推动力增加通气量、提高氧分压；延长氧的停留时间：提高搅拌转速、搅拌器形式；,3、典型产品的发酵生产3.1 谷氨基酸发酵AA是构成蛋白成分；目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,氨基酸的用途(1)食品工业：强化食品：(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸)增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 甜味剂：苯丙氨酸与天冬氨酸生成低热量二肽(-天冬酰苯丙氨酸甲酯)。,(2)饲料工业：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料(3)医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调；苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效，且副作用低。(4)化学工业：谷氨基钠作洗涤剂，丙氨酸制造丙氨酸纤维。,3.1.1 生产菌株棒状杆菌、短杆菌、小杆菌（B9、AS1.542、AS1.299）、T613(天津)、7338(北京)，都是需氧型细菌；野生菌株发酵；营养缺陷型突变发酵；抗AA结构类似物突变株发酵；抗AA结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发；营养缺陷型回复突变株发酵；,3.1.2 培养基 各级培养基要求不同，总原则：逐渐趋于工业化原料。,我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。各级种子基本要素相同，但原料不同；（1）斜面培养：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。,（2）一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。（3）二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。（4）发酵 水解糖液(或糖蜜)+尿素+玉米浆,3.1.3 发酵工艺控制（1）适应期：pH上升（尿素分解出氨使），糖不利用。2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。（2）对数生长期：糖耗快，pH又迅速下降(因氨被利用)。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30-32,两个耗糖高速期：,1.延滞期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期,耗糖高速期,耗糖高速期,（3）菌体生长停止期：谷氨酸合成。措施：流加氨（提供氮、维持pH在7.2-7.4）。大量通气，控制温度34-37。（4）发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。发酵周期一般为30h。注意：（1）控制磷酸盐浓度（必需，但不过量，否则做成缬氨酸发酵）；（2）防治噬菌体污染；,（3）控制好生物素的量：当生物素（玉米浆）过量时，可添加青霉素或更换菌株法来解决。在生物素过量时，为什么说添加青霉素是有效的？,3.1.4 提取（1）等电点法：利用氨基酸分子的“两性”谷氨酸等电点（pI）3.2 操作简单，收率60。周期长，占地面积大。,（2）离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。（3）硫酸锌盐沉淀法(C5H8O4N)2Zn（4）等电点离子交换法（国内最常用）,R-SO3-H+NH2+CHRCOOH R-SO3-H3+NCHRCOOH用NaOH洗脱，得谷氨酸,谷氨酸发酵研究新进展,(1)选育各种生化突变菌株转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。(2)生物工程新技术的应用固定化细胞技术、体外DNA重组、原生质体融合技术。(3)改进发酵工艺开拓原料(如醋酸发酵)；改进流加工艺或连续发酵；优化发酵条件：通过电子计算机控制发酵条件；,3.2 白酒生产工艺3.2.1 绪论（1）白酒的起源酒：旧石器时代，有果酒和奶酒；新石器时代：有谷物酿酒；世界技术发展史公认的蒸馏酒起源地有三个：中国、印度、阿拉伯国家；起源于古代“炼丹术”（东方）和“香料提取技术”（印度和中东）；,酿造酒：含糖物质（水果、乳类、糖类、谷物），经酵母发酵，过滤或压榨而得酒度低、刺激性弱的酒。世界三大酿造酒黄酒、葡萄酒和啤酒蒸馏酒：含糖物质（水果、乳类、糖类、谷物），经酵母发酵，蒸馏而得的透明的、含酒精（大于20%v/v）的饮料。,中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一。有关其起源，有多种说法：（1）元代起源说：本草纲目“烧酒非古法也，自元时始创”。（2）金代起源说：邢润川从所发现的金代铜制烧锅的结构与元代朱德润所描述的蒸馏器结构相同。（3）东汉起源说：东汉时期的青铜蒸馏器+四川新都、彭州出土带有描述蒸酒画像的东汉晚期的砖墙。世界技术史学家认同东汉起源说；大众流行饮用酒的历史只有500-600年。,（二）蒸馏酒的种类（1）中国白酒 以淀粉质原料原料，以中国酒曲为糖化酵剂，经固态或半固态发酵，再经蒸馏提高酒度而制成的含酒精饮料。特点：酒精含量高。色、香、味宜人，“色泽澄清透明、玉洁冰清，香气馥郁芬芳、优雅细腻，味甘润柔和、醇厚绵甜，余味净爽，风格独特”。,（2）威士忌原料：大、小、燕麦、黑麦、玉米；糖化剂：麦芽；苏格兰威士忌(SCOTCH WHlSKY)：世界上销量最大的威士忌；根据麦芽汁的特点，苏格兰威忌分三类:,纯麦型：大麦麦芽糖化 发酵釡蒸馏2次橡木桶贮存；粮谷型：大麦或玉米(80%)+麦芽(20%)糖化 发酵 塔式蒸馏 橡木桶贮存3年 调配；兑和型：多种单体(大麦、玉米、麦芽)威士忌按一定比例兑和而成；,爱尔兰美国波本加拿大,粮谷型威士忌,兑和型(8种以上的单体)威士忌,（3）俄得克(伏特加)谷物发酵 蒸馏 高纯度酒精+软水活性炭处理过滤；,（4）金酒(杜松子酒)谷物酒串蒸杜松子或香料蒸馏酒。,（5）老姆酒(RUM)甘蔗或糖蜜发酵蒸馏橡木桶。,轻型：纯酵母发酵(古巴)；,浓型：酵母+丁酸菌共酵(牙买加);,老姆酒,（6）白兰地 它是以水果为原料，经发酵、蒸馏制成的酒，再经橡木桶贮存而成的酒。,（7）烧耐：原料:薯类、玉米;,烧耐,甲类烧酒：酒精材料蒸馏(连续式蒸馏机)酒(36度);,乙类烧酒：酒精材料蒸馏(单式蒸馏机)酒(45度);,（三）中国白酒（蒸馏酒）的分类：（1）按使用的曲分类A、大曲酒。（20%）B、小曲酒。（10%）C、麸曲酒。（70%）,（2）按酒度分类 高度白酒：41%65%（V）低度白酒：40%（V）（3）按生产工艺分类,（4）按白酒的香型分类（1979年全国第三次评酒会上提出）A、浓香型B、酱香型C、清香型D、米香型E、其他香型药香型（贵州遵义董酒位代表）兼香型（湖北松滋白云边为代表）凤型（陕西凤翔西凤酒为代表）特型（江西樟树四特酒为代表）豉香型（广东佛山玉冰烧为代表）芝麻香型（山东景芝白干为代表）。,(二)大曲生产工艺原料：小麦、大麦、豌豆等工艺：原料粉碎掺水压制曲坯控温、控湿成熟曲（糖化发酵剂）。多种自然繁殖的微生物（霉菌、酵母菌、细菌）。多种酶类（淀粉酶、蛋白酶）。微生物种类、数量受制曲原料、制曲温度、环境等因素的影响。,(三)常见大曲酒生产工艺,原料,粉碎,出窖配料,扬凉,蒸馏糊化,加曲,加水,入窖,糖化发酵,酒醅,酒,续渣混烧操作,第一排,第二排,第三排,第四排,老五甑循环工艺,小渣,大渣1,大渣2,回糟,回糟,大渣1,大渣2,小渣,新料,丢糟,不同企业，渣在窖中的位置可能不同。,丢糟,原料,粉碎,出窖配料,扬凉,蒸馏糊化,加曲,加水,入窖,糖化发酵,酒醅,蒸馏,酒,丢糟,续 渣 混 烧 操 作,1、浓香型白酒的生产工艺,扔糟,酿制特点：偏高温曲（原料和温度）；老五甑续糟混蒸-“千年窖，万年糟”；泥窖发酵；,2、汾香型白酒工艺清蒸清烧工艺,酿制特点：采用清蒸二次清工艺：一次投料，2次发酵，2次蒸酒；蒸粮蒸酒分开进行，突出一个“清”；中温曲（原料和温度）；小米糠作辅料；地缸发酵，突出“净”；,3、酱香型白酒工艺,酿制特点：（1）两次投料、八次发酵、七次流酒。（2）大曲用量大（曲：料=1：1）。（3）糟醅原出原入（以醅养窖和以窖养醅，一定程度抑制有害微生物的生长繁殖）；（4）三高：小麦高温曲；高温堆集(发酵)；高温流酒；（5）木柴烧窖杀灭窖内杂菌，除去枯糟味和提高窖温；,4、白酒蒸馏工艺蒸馏作用（1）分离与浓缩作用除去有害物；提取和浓缩酒精与香味成分；（2）杀菌及糊化（3）引起物质变化酯化；美拉德反应（“非酶棕色化反应”，羰氨反应）等；,（4）蒸馏方式甑桶水蒸汽蒸馏：有别于蒸发，传质效果不同；填料塔：酒糟既是填料又是蒸馏对象；（5）蒸馏原理水乙醇，水分子强的氢键作用力与其它分子（甲醇、乙醇、异戊醇）缔合，这种缔合力：甲醇乙醇异戊醇，所以，在蒸馏时，异戊醇在酒头，甲醇集中在酒尾。结论：在固态蒸馏中，决定组分分离效果的不是沸点，而是组分间引力大小。水分子的氢键作用力：酸醇酯；K=1的组分在酒度75-80%处聚集；,（6）蒸馏操作 装甑原则：“装甑要轻巧、物料要疏松、撒料与上汽要均匀、盖料要准确、每层物料要薄、物料从下至上要平”；装甑方法：见湿盖料或见汽盖料；,蒸馏汽量的掌握：缓汽蒸馏，大汽追尾；接酒温度：30 或40，太高散失香味；保证换热面积，避免憋汽；看花取酒：大清花酒度高；小清花酒度低；当无花有油珠出现时，停止摘酒；掐头去尾：酒头酒尾的具体摘取量应根据原料种类、好坏、产品质量指标而定；,3.3 抗生素发酵生产 3.3.1 生产菌株 由Q176(产黄青霉)改良（诱变或基因工程技术）3.3.2 培养基 C、N、前体、无机盐（Fe含量30ug/ml）3.3.3 工艺,菌种(strain)：产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)孢子培养(spore cultivation)：25 C,6-7 d种子培养(seed cultivation)：25 C，2-3 d 发酵培养(fermentation)：22-26 C,6-7 d加糖控制(sugar feeding)：残糖降至0.6；,青 霉 素 发 酵(1)Penicillin Fermentation,补氮(nitrogen feeding)：氨控制在 0.01-0.05前体(precursor)：残余苯乙酰胺 0.05-0.08温度控制(temperature)：前期 25-26 C；后期 23 C通气与搅拌(aeration&stir)：1:0.8 VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油；,青 霉 素 发 酵(2)Penicillin Fermentation,END,