第6章 沉淀反应.ppt.ppt

,第六章 沉淀反应,第六章 沉淀反应,第一节 沉淀反应的特点第二节液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定,第三节凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验第四节 免疫电泳技术 一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳 四、免疫固定电泳,思考题小结,第一节 沉淀反应原理及特点,沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件（PH、电解质等）下发生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗原抗体反应相同。,1898年Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉淀现象；1905年Bechgold 发现沉淀可以在明胶中进行；1965年Mancini发明单向免疫扩散技术；上世纪70年代免疫浊度法出现。上述技术的发明发展，使得沉淀反应向快速、准确、微量、自动化方向发展，在医学检验中的应用越来越广泛。,形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物,第一阶段,第二阶段,沉淀反应分两个阶段,抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率。,经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判断结果，称为终点法需要几十分钟到数小时；在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。,免疫浊度测定絮状沉淀试验,单向扩散试验双向扩散试验,对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳,液体内沉淀试验,凝胶内沉淀试验,凝胶免疫电泳技术,沉淀反应可分三类,第二节液体内沉淀试验,絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例(三种类型),一、絮状沉淀试验,抗原稀释法：抗原最适比例,抗体稀释法：抗体最适比例,方阵滴定法：抗原抗体最适比例,絮状沉淀试验,将抗原作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物随抗原量的变化而不同。抗原抗体比例适当时，形成的沉淀物最多。,将抗体作系列稀释，与恒量浓度的抗血清等量混合反应后，产生的沉淀物随抗体量的变化而不同。,将以上两种方法结合，将抗原抗体同时稀释，找出最佳比例。,表6-1 最适比方阵测定法,当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度的改变。利用现代光学测量仪器与自动化检测分析相结合对浊度进行测定从而检测微量抗原或抗体。,原 理,二、免疫浊度测定,1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量高剂量钩状反应(high dose hook effect)：当抗原过剩时，形成的IC分子小，而且容易离解，浊度反而下降。用抗体检测抗原，当反应液中抗体过量时，在一定范围内，IC的形成量与抗原量的递增正比，当抗原量递增至抗原抗体最佳比例时，IC的形成到达高峰。如再增加抗原量，IC的形成量反而减少。因此，如检测时抗原过量则得出错误的检测结果。反应体系中保持抗体过量。2.抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力强并使用R型抗体(等价带宽)3.抗原抗体反应液的最适PH为6.58.5 4.使用增浊剂,影响因素,免疫浊度测定,1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法,分类,免疫浊度测定,经典的沉淀试验有四个缺点无法克服：操作繁琐；灵敏度低(10-100g)；时间长；难以自动化。,第三节凝胶内沉淀试验,可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。要求：1、单价特异性抗血清（是指血清只与其特异性抗原发生反应）；2、标准品；3、灵敏度1.25g/ml,原理,原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。,技术要点：将抗体混入0.9%琼脂糖内（50），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径35mm），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37,2448h 观察孔周围是否出现沉淀环。,定量试验,一、单向扩散试验（平板法）,倾注平板打孔加样 放置372448h观察沉淀环,单向扩散试验（平板法）,沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法,Mancini曲线：大分子抗原（IgM）时间扩散48h，常数KCd2普通坐标纸曲线,Fahey曲线：小分子抗原（IgG,IgA）扩散时间24h常数KlogCd 半对数坐标纸曲线,C为抗原浓度，d为沉淀环直径,单向扩散试验（平板法）,T1为1624h；T2为2448h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线,t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线,Mancini曲线,Fahey曲线,影响因素：抗体质量标准曲线，质控血清结果与真实含量不符单克隆抗体+多态性抗原=假性降低；多克隆抗体+单克隆病=假性升高；双环现象抗原性相同、扩散率不同的两个组分：重链病人血清中的重链与正常IgA,单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清,单向扩散试验（平板法）,原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。,技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在35 mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒371824h 后，观察孔周围是否出现沉淀环。,鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一,二、双向扩散试验（平板法）,1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量(位置)的估计,2.抗原或抗体相对分子量（形状）的估计,双向扩散试验（平板法）,应用,3.抗原性质的分析,双向扩散试验（平板法）,Ab,Ab,Ab,应用,4.抗体效价的滴定,5.抗原或抗体纯度的鉴定:MixAg+Ab/MixAb+Ag=one band(pure)/several band(impure),双向扩散试验（平板法）,简单易行，用途广泛；灵敏度低1.25g/ml，反应慢，不能精确定量,双向扩散试验（平板法）,第四节免疫电泳技术,优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度（g/ml）。3.增加了分辨率。,电泳分析,沉淀反应,抗原抗体反应的高度特异性,电泳技术的高分辨率、快速、微量,免疫电泳技术,原理：双向扩散+电泳比双向扩散试验灵敏度提高816倍,技术要点：制备1.2%巴比妥琼脂凝胶板，在其上成对打孔，孔径3mm，孔距6 mm，于阴极侧孔内加待测血清，阳性侧孔加抗血清，电泳条件34mA/cm，30min1h，pH8.6 buffer。,一、对流免疫电泳,蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动,抗体球蛋白(PI6-7)带负电荷较少，籍电渗(水流)作用向负极泳动,对流免疫电泳,IgG3/IgG4,IgG1/IgG2,结果分析：无沉淀线出现则表明无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度抗原，反之，则是抗体浓度抗原浓度。,对流免疫电泳,+,+,+,电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。,原理,单向免疫扩散电泳,定量检测技术,二、火箭免疫电泳,1.2%巴比妥琼脂糖约55，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。,技术要点,火箭免疫电泳,火箭免疫电泳示意图,沉淀峰高,抗原浓度,1.测定沉淀峰高度2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度,绘制标准曲线,染色标本结果,火箭免疫电泳,1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定（云雾状、圆形火箭窄峰）。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），只带负电荷，抵消了电渗作用。,影响因素,火箭免疫电泳,提高灵敏度：免疫自显影技术（加入125I标记的标准抗原，免疫竞争性法检测目的抗原）,原理：区带电泳双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散。,技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电泳23mA/cm，0.51h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。,三、免疫电泳,纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定,影响因素,抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比,抗血清的的抗体谱，混合抗血清的使用,电泳条件直接影响分辨率,应用,免疫电泳,免疫电泳示意图,骨髓瘤血清,正常人血清,Albumin,Alpha 1,Alpha 2,Beta,Gamma,免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型,原理,区带电泳沉淀反应,四、免疫固定电泳,先将患者血清或血浆(未变性)在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、轻链和轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应M蛋白成分。,技术要点,免疫固定电泳,左图为IgG 型,中图为IgG 型，右为正常（无单链）,免疫固定电泳示意图,Antibody:,分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。,应用,最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与、分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。,优点,免疫固定电泳,M蛋白：经免疫电泳及化学分析证明它是由单克隆浆细胞分泌的结构均一的免疫球蛋白或多肽链亚单位(轻链)，即单克隆免疫球蛋白，或称M蛋白。,1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测。3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于M蛋白的鉴定与分型。,沉淀反应在医学检验中的应用,沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出的沉淀现象.根据沉淀反应介质和检测方法的不同，将其分为液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验和凝胶免疫电泳试验三大基本类型。免疫浊法度测定为液体内沉淀试验；单向扩散试验平板法是一种定量的凝胶内沉淀试验，免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。,小 结,1.什么是沉淀反应？2.沉淀反应的特点？3.免疫浊度法的原理、方法与分类？4.单向扩散试验的原理和应用？5.免疫固定电泳的原理及临床应用价值？6.何谓Mancini曲线？7.何谓Fahey曲线？8.影响免疫比浊测定的因素有哪些？9.抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？10.自动化免疫比浊法发展趋势和应用前景？,思考题,