实时荧光定量PCR技术与应用.ppt

实时荧光定量PCR技术与应用,北京元业伯乐科技发展有限公司,提纲,PCR概念,什么是PCR？Polymerase Chain Reaction(PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。,PCR 循环,第一步 加热变性、双链打开,第二步退火、引物与单链结合,第三步-引物延伸,变为两个双链DNA,常规PCR,常规PCR技术：理论上PCR产物的积累是按照2n指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析,DNA Engine,常规PCR,常规PCR结合电泳分析方法的局限性,只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差1000%）存在扩增产物的污染问题。必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒无法对扩增反应实时检测,提纲,定量PCR,定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,IQ5 Real-time PCR仪,定量PCR,实时荧光定量PCR三个关键词：实时，荧光，定量 如何实时检测？借助荧光物质示踪扩增产物量的变化,PCR反应混合物,荧光曲线,随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图,定量原理,如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念：荧光阈值、Ct值,定量原理,荧光阈值,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准),阈值线,Ct值的概念,定量原理,Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数,阈值线,模板起始浓度越高，Ct值越小,定量原理,CT值与模板起始浓度的关系,哪个样品浓度高？,为什么要用Ct值定量,实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。,Ct值的重现性,终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性,Ct值的重现性,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图,阈值选择,阈值的选择,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑,定量原理,理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+log N(3)Ct=-1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex)(4)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,定量原理,初始模板的对数值与循环数（CT值)呈线性关系初始模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少,确定初始模板的浓度,定量原理,Absolute（绝对定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Relative（相对定量）Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a standard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene,定量方法,定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。,绝对定量,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,.,未知,104,103,106,105,102,10,首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值,Unknown contains 3108 copies,绝对定量,Livak Comparative Ct Method(2-DDCt)for Relative Quantification,1.Normalize C(t):C(t)=C(t)target-C(t)hskg,2.Calculate C(t)Average:C(t)Ave=Average C(t)of replicates,3.Normalize to calibrator:C(t)=C(t)Sample Ave-C(t)Calibrator Ave(For calibrator,C(t)=0),4.Fold difference:F=2-C(t)=Normalized fold difference(For calibrator,2-C(t)=1),Note,this formula can be modified to account for reaction efficiencies(Dr.M.Pfaffl)and multiple reference genes(Dr.J.Vondosomple).,相对定量非标准曲线法,Quantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acidAt least 2 concurrent standard curves are usedOne for gene(s)of interestAt least one for reference geneStandard curves account for reaction efficiencies,使用标准曲线法进行相对定量分析,相对定量标准曲线法,与传统PCR的比较,实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力检测设计灵活,提纲,SYBR Green 1,Molecular Beacons,TaqMan,荧光化学,SYBR Green I,SYBR Green 1,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光,SYBR Green I 工作原理,Extension,Extension ContinuedApply ExcitationWavelength,Repeat,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I 优点,使用方便-不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性-可以用于不同的模板 便宜 灵敏,SYBR Green I 缺点,与非特异性产物结合无法实现多个目的基因的检测,关于SYBR Green I,一种最基础的实验手段,评价引物特异性：使用熔点曲线分析（Melt Curve Analysis）评价引物对扩增效率：将模板进行梯度稀释研究最适反应条件：使用梯度功能进一步优化实验条件,Molecular Beacons,Molecular Beacons,发夹型杂交探针,Molecular Beacons,原理：荧光偏振能量传递（FRET）,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列完全配对,变性:产生非特异性的荧光,Molecular Beacons,Target-loop interaction more stable than stem-stem,退火时:探针与靶序列结合荧光素与淬灭剂分离发出荧光（靶序列特异的）,Molecular Beacons,延伸:没有荧光,Molecular Beacons SNP,Molecular Beacons 实验结果,Molecular Beacons 优点,对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一 可以实现多通道检测 荧光背景低,Molecular Beacons缺点,设计困难 只能用于一个特定的目标 价格较高,TaqMan,探针,荧光素,淬灭剂,TaqMan,水解型杂交探针,TaqMan,目标特异性探针 5为荧光素，3为淬灭剂,与目标序列互补,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,TaqMan工作原理,Extension Step,1.Strand Displacement,2.Cleavage,3.PolymerizationComplete,4.Detection,l,TaqMan工作原理,TaqMan实验结果,TaqMan优点,对目标序列有很高的特异性-特别适合于SNP检测可以实现多通道检测 与 Molecular Beacons 相比设计 相对简单,TaqMan缺点,价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析 背景高,兼容化学试剂总结,提纲,多重PCR,在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应：,同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基因（看家基因）不同荧光标记的探针识别不同的靶基因,内参照基因,解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别,内参照基因,多通道技术,多通道技术：,使用多种荧光染料在不同的检测通道内同时测定多种不同荧光染料发出的荧光,1、引物及探针问题-引物及探针的相互干扰2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行2、模板量差别-共用资源的相互竞争,多重PCR技术问题,一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题：,F,R,多重PCR技术问题,1、引物及探针相互干扰问题,2、共用资源的相互竞争,多重PCR技术问题,单双通道同时进行，相互验证,多重PCR技术问题,提纲,表达差异,基因表达差异分析（替代Northern Blot)：responses to a particular stimulustissue differentiationstages of developmentcell proliferationdisease state progression,研究方面部分应用,Two-color-real-time qPCR assay for Cancer marker expression using TaqMan probes,应用实例,Cancer marker expression,TaqMan chemistryMultiplexingExpression differences of ERBB2 in neoplastic breast tissue samples,Cancer marker expression,ERBB2 oncogeneTransmembrane tyrosine kinase overexpressed in 25%of breast cancer casesIncreased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatmentsGAPDH housekeeping gene for normalization,材料和方法,从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controlsno RNARNA+no reverse transcriptase,实验材料,材料和方法,材料和方法,50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate readgo to step 3,39 more times10C,foreverEnd,Color 2-VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,实验结果,实验结果,实验结果,ERBB2单双通道相互验证的实验结果,HealthyRNA,TumorRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,2.16 X,1.45 X,Copies ng/l Total RNA,实验结果,实验结果,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2,1.4,1.6,1.8,2,HealthyTissue,Carc.Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,实验结果,讨论,利用RT-qPCR在Opticon2上成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量提高到正常水平的1.8倍,提纲,Graph fluorescence intensity vs.temperature Decreasing fluorescence recorded-Due to increasing temperature-Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curve,SYBR Green I 融解曲线分析,荧光强度值随温度变化速率对温度作图(-dI/dT),SYBR Green I 融解曲线分析,SYBR Green I 融解曲线分析,扩增曲线,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.,SYBR Green I 融解曲线分析,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.,扩增曲线,SYBR Green I 融解曲线分析,进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度,Real-time PCR体系优化,利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化,Real-time PCR体系优化,溶解曲线,扩增曲线,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Read7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readevery 0.2oC,hold 1 sec.,Real-time PCR体系优化,提纲,用TaqMan探针进行基因型分析,SNP检测-基因型分析,Q,多色双通道技术应用-基因型分析,从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类：A/A(Allele 1)G/G(Allele 2)G/A(Heterozygote),多色双通道技术应用-基因型分析,Allele 1 control,多色双通道技术应用-基因型分析,Allele 2 control,VIC,FAM,多色双通道技术应用-基因型分析,Heterozygote control,FAM,VIC,多色双通道技术应用-基因型分析,SYBR Green I进行SNP分析,Mismatches are extended at 1,000 fold lower efficiency,resulting in 10-cycle delay in product accumulation,Both matches and mismatches can amplify with similar final quantity of product,SYBR Green I进行SNP分析,SYBR Green I进行基因分型,SYBR Green I进行基因分型,实时荧光定量PCR应用,定量：DNA定量 RNA定量定性：SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析,感谢各位光临！,