免疫组化与原位杂交.ppt

免疫组化与原位杂交,免疫组织化学的主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。,抗原(Antigen)：凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性(Antigenicity)。,一、抗原和抗体,抗体(Antibody)：是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，称为免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。,1、多克隆抗体：多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物（大多数为兔），并从该动物血中所获得的免疫血清。它是针对抗原分子上多个抗原决定簇的多个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。2、单克隆抗体：单克隆抗体是应用细胞融合杂交瘤技术通过免疫动物（大多数为小鼠）而制备的。它是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。,抗原与抗体的关系：没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗原物质，也无法检测抗体的存在，利用抗体可以检测抗原物质。,二、细胞和组织标本的取材和固定 由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。,1、细胞标本的取材：穿刺吸取涂片法该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不宜加固定液。,取材：,培养细胞标本的取材:可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。,2、组织标本的取材：组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡 2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。,为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冰块进行冰冻切片，或立即用固定液处理，进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70冰箱内备用。,固定：固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。,1、固定剂：用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其要重视固定剂的选择。常用醛类固定剂。,2、注意事项：应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不宜过大过厚,必须小于2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。,3、固定方法：浸入法(Immersion method)：将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温(4)环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在212h之间。,灌注法(Irrigation method)：此法适用于动物实验研究。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织，达到充分固定之目的。灌注中洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。,三、玻片的处理,洗涤载玻片防脱片剂(APES)处理,四、组织切片应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在 20100m，有利于追踪神经纤维的走行。,冰冻切片:是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。,石蜡切片:其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。,五、抗原修复,抗原修复是指通过加热或酶消化的方法使经醛类固定剂处理的组织的免疫组化染色效果增进。,常用的抗原修复方法,胰蛋白酶消化法：可打开醛键，解除交联，暴露抗原高压加热法：保持高压5分钟，后使液体缓慢恢复至室温。可暴露抗原微波加热法：10分钟或5分钟2次。可解除交联。,六、免疫组化染色的一般步骤,1、石蜡切片脱蜡到水：2、预处理：需要时可选用3%过氧化氢溶液阻断过氧化物酶。3、抗原修复处理：根据需要选用,4、染色：PBS液洗涤：5分钟2次；正常山羊血清封闭：室温或3720分钟；滴加一抗：37 1-2小时或4 过夜；PBS液洗涤：5分钟2次；滴加二抗：室温或37 30分钟；PBS液洗涤：5分钟2次；SABC：室温或37 30分钟；PBS液洗涤：5分钟4次。,注：一抗为针对抗原的特异性抗体。二抗一般为生物素化二抗，即生物素化羊抗小鼠或生物素化羊抗兔。SABC即ABC复合物（亲合素-生物素-过氧化物酶复合物）。,5、检测：即显色反应 酶作用底物：DAB辣根过氧化物酶 NBT/BCIP碱性磷酸酶6、复染：苏木素、核红、1-2%甲基绿7、脱水、透明、封片：,抗体的保存和配制：1、抗体的保存：放入-20-40冰箱中保存备用,一般可保存12年。小量分装的抗体可1次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在 4可存放13天，超过7天效价显著降低。有浓缩抗体和即用型抗体。,七、免疫组化染色注意事项,2、抗体的配制：,抗体稀释的配制：常用0.01mol/L pH7.4 PBS 缓冲液作抗体稀释液。抗体的最佳稀释度：由于各种抗体的效价不 同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况 作适当的调整。常为1：100或1：200。,正确设计对照方法：其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照。常用的对照方法包括：阳性对照；阴性对照；阻断试验；替代对照；空白对照；自身对照；吸收试验。,1、阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。,2、阴性对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。,出现假阳性的几种原因：,切片在染色过程中抗体过浓多克隆抗体的交叉反应,出现假阴性的几种原因：,抗体和检测试剂盒配对是否合理抗体的浓度过低孵育的时间太短固定和温度染色步骤是否正确染色过程中切片过分干燥,出现背景着色的几种原因：,内源性过氧化物酶没有完全阻断正常动物血清使用不合理，应用与二抗相同种属非免疫血清脱蜡不够彻底粘附剂使用不当或太浓PBS洗涤不够抗体稀释不合理，浓度太高底物显色时间太长,显示剂的合理使用：,酶作用底物：DAB辣根过氧化物酶 NBT/BCIP碱性磷酸酶,免疫组化结果的判断标准：,1、必须设对照：设阴性对照和阳性对照2、抗原表达必须在特定部位：分胞浆、胞核及胞膜表达3、阴性结果不能视为抗原不表达：,4、阳性细胞的染色特征：免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。阳性细胞染色分布有三种类型：细胞浆；细胞核；细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性。,由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。,5、阳性结果的定量判断：常规办法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、+、+等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另一种先进的免疫细胞化学计量分类技术流式细胞光度计技术。,原位杂交组织化学技术,In situ hybridization immunocytochemisty technique，ISHI,原位杂交组织化学技术是将核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项新技术，先用标记的已知核酸序列片段作为探针，与组织、细胞内待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，再通过组织化学或免疫组化方法在细胞原位呈色显示杂交信号。,一、分子杂交的基本原理,按碱基配对原则，两条核苷酸单链(DNA，DNA或DNA，RNA)中，一条碱基序列与另一条碱基互补配对，在一定条件下可形成双链复合体。原位分子杂交技术利用已知核苷酸序列DNA片段作为探针，按碱基配对互补原则识别并特异性结合待测DNA或RNA(组织切片或细胞涂片)。,二、探针,1）探针的选择dsDNA，cDNAssRNA，ssDNA，寡核苷酸,2）探针的制备DNA片段的分离cDNA:克隆RNA:克隆在转录载体上寡核苷酸:化学合成,3）探针的标记同位素、荧光素、生物素、地高辛等,核酸探针种类,根据标记方法 放射性探针 非放射性探针根据核酸结构 双链cDNA 单链cDNA 合成寡核苷酸 单链cRNA,根据核酸性质 DNA探针 RNA探针 cDNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针,三、组织切片与培养细胞原位杂交技术,实验前准备：,1、试剂的配制：如DEPC水的配制 原位杂交所有液体试剂都应经DEPC水处理。灭活蛋白质，抑制RNA酶。方法：取DEPC 1ml加入1000ml蒸馏水中，经猛烈振摇后，室温静置数小时，然后高压灭菌。,载玻片先用洗洁精浸泡过夜或酸泡；用自来水冲洗，双蒸水洗2-3次；置180干烤2h，或经15磅高压灭菌20min。Lysine涂片，干燥后使用。或2 APES浸片，晾干，180干烤，备用。,2、载玻片的处理：,注：由于ISH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片 上，干燥后待切片时应用，以保证在整个 实验过程中切片不致脱落。,新盖玻片分散开，在通风条件下于0.1mol/L HCl中煮20min，冷却后，倒掉盐酸；用去离子水漂洗后，竖放在架子上自然干燥；硅化盖玻片（在通风条件下），将单块盖玻片在DMDC(二甲二氯硅烷)液中浸泡数分钟，然后竖放在架子上干燥；收集干燥盖玻片放于培养皿中，用去离子水漂洗数次；用铝箔将放盖玻片的培养皿包好，于180干烤4h，取出冷至室温后，进行后续处理。,3、盖玻片的处理：,注：硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。,取材：,DNA比较稳定，mRNA容易降解，在取材时组织标本应尽可能新鲜。外科手术标本，取材后立即置于冰上，尽量减少RNA降解。一般新鲜组织和培养细胞应30min内固定。避免外源性RNA酶引起靶组织RNA丧失，取材时戴一次性手套。所用物品经DEPC水处理高压灭菌，所用溶液用DEPC水配制。,固定的目的避免核酸降解保存组织形态结构增加组织通透性,固定：,组织切片或细胞涂片的准备：,1、组织切片：,冰冻切片 手术室取材，标本用OCT（甲基纤维素）包埋，液氮速冻，恒冷切片机切片(6-8m)；4多聚甲醛固定2Omin，放置37，PBS洗后逐级酒精脱水，低温-20至-70保存。石蜡切片4多聚甲醛（4福尔马林）4固定24-48h；清洁玻片涂粘附剂（2APES或多聚赖氨酸，明胶)；常规石蜡切片，置60 24-48h。,2、培养细胞或细胞涂片：,新鲜细胞4多聚甲醛4固定10min，自然干燥；标本置-8O保存。细胞涂片的制备冰醋酸:乙醇(3:1)4固定20min，离心弃上清液；用新鲜固定液调整细胞浓度；将细胞滴在湿载片上，略干；乙醇脱水330min；正丁醇室温下处理，空气中干燥，准备杂交。,1、脱蜡：石蜡切片常规脱蜡 二甲苯梯度酒精水,地高辛标记探针原位杂交步骤：,3%H2O2（30%H2O21份蒸馏水9份混合），室温孵育5-10分钟，以灭活内源性过氧化物酶蒸馏水洗涤5分钟3次暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3%柠檬酸2滴浓缩型胃蛋白酶），370C或室温消化3-30分钟PBS洗涤5分钟3次双蒸水（ddH2O2）洗涤5分钟1次后固定：固定液为1%PFA/0.1MPBS（PH7.2-7.4），室温固定10分钟ddH2O2洗涤5分钟3次,2、杂交前处理：,3、预杂交：,在湿盒内加20%甘油20ml以保持湿度，每张切片滴加20l预杂交液，置于恒温箱内30min-2h，吸取多于液体，不洗。,4、杂交：将探针DNA和杂交液混合后，煮沸变性10min，迅速置冰上冷却；每张切片滴加10-20l变性杂交液，盖上硅化盖玻片；将切片放入2SSC湿盒内，38-42温箱孵育24-36h杂交。,5、杂交后处理：,揭掉盖玻片，372SSC洗涤5分钟2次37 0.5SSC洗涤15分钟1次37 0.2SSC洗涤15分钟1次滴加封闭液：37 30分钟。甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛：37 60分钟或室温120分钟PBS洗涤，5分钟4次,滴加试剂SABC，37 20分钟或室温30分钟PBS洗涤，5分钟4次DAB显色：镜下控制显色时间20-30分钟蒸馏水洗涤，充分水洗苏木精复染盐酸乙醇分化脱水、透明、封片。,对照试验：,确保原位杂交实验操作和结果的准确性、特异性、敏感性和重复性。阳性对照阴性对照,阳性结果的定量判断：,常规办法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、+、+等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量。,可能存在的问题及对策：,(1)探针标记的质量：同位素探针的比放射性（cpm/g）强度（如浓度达0.5ng/l，3-H标记核酸探针为10 8 cpm/l；35-S，32-P为510 8110 9 cpm/l）；非同位素探针 10 pg，达到2 ng l。(2)探针保存的时间：DNA探针保存可达1年，要注意同位素探针的半率期；RNA探针不稳定，应在-20以下保存，可达6个月。,1、探针的问题：,组织应及时充分固定。活组织离体30分钟内固定；固定时间要充分；组织块固定12小时,不超过2周。切片放入冰箱中保存。,2、组织材料及切片的保存：,消化酶的浓度：过低：待测核酸暴露不充分，从而降低杂交信号或没有杂交信号。过高：组织结构受到严重损害，核酸游离，切片易碎或脱片。蛋白酶失活。核酸酶（如RNase）污染。,3、切片的预处理：,杂交温度：过高或过低，探针和待测核酸的杂交体都不易形成。杂交环境：漂浮切片法杂交环境相对稳定；贴片法杂交环境不稳定（如湿盒蒸汽对探针的稀释等）。,4、杂交过程：,载玻片不干净包被（涂片胶）不合适 蛋白酶浓度偏高。,5、脱片：,探针特异性不高（目的基因过少、载体核苷酸比重过多）；组织中某些成分与显示系统中的抗体成分非特异性结合（可使用动物血清或白蛋白封闭）；抑制内源性酶（用H2O2处理）。,6、非特异性染色：,