乳酸菌及其在水产养殖中的应用研究进展.ppt

乳酸菌及其在水产养殖中的应用/研究进展,徐中平日照职业技术学院水产学院,益生菌,Rosenfeld W D等，1947，首次描述了一种能够产生抗菌效应的海洋微生物。Parker R B 1974，将益生菌的概念定义为“有助于肠道微生物平衡的生物和物质”。Kozasa M，1986，“首次使益生菌应用予水产养殖，使得益生菌研究褥到了迅速发展。Fuller R，1989，将益生菌定义为“熊够改善宿主动物的肠道体系平衡的一种添加在饲料中的活的微生物”。,目前益生菌的应用及其作用机制的科学研究表明，微生物体内的一些物质成分也能起到有益于宿主的作用，这种有益的作用不只局限于宿主的肠道区域。Moriarty D J WL建议将水产养殖业中的益生菌的定义范围扩大为“微生物添加剂”1998。2001，WHO组织阐述了益生菌的概念：当宿主动物摄入适量的活的微生物时，自身的免疫力得到提高，这类活的微生物即为益生菌。,益生菌应用于水产养殖,改善养殖体系的水体环境；在宿主体内分泌营养物质和消化酶，提高宿主的抗病性，改善其兔疫系统，降低疾病的发病率，进而提高水产养殖业的产量和经济效益。,益生茵的种类,作用于养殖水体的益生菌复合制剂，如美菌方、复合型活性生物净水剂等，主要由硝化和反硝化细菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、酵母菌、粪链球菌等菌株组成,单一微生物制剂如光合细菌(Photosynthetic bacteria)、乳酸菌(Lactic acidbacteria)、酵母菌(Yeast)、中间气单胞菌(Aeromonas media)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、乳酸杆菌(Lactobacillus、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)等。,乳酸菌(Lacticacidbacterium，LAB),乳酸菌(Lacticacidbacterium，LAB)是一群能利用发酵性碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。,1 生物特性,菌群乳酸菌有44个种，连同亚种共51个种，革兰氏阳性、无芽孢，厌氧或兼性厌氧，不运动耐酸，在pH3.04.5时仍可生长。恒温动物和鱼类胃肠道中广泛分布但该菌在生长过程中不形成芽孢，抗逆性差，易失活而难于保藏，所以，在饲料中的添加使用应加以注意。,有9个属：其中5个属呈球状，如乳酸球菌/乳球菌(Lactococcus)链球菌(streptococcus)等；,明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、肠球菌(Enterococcus)、,4个属呈杆状，如乳酸杆菌(1actobacillus)双歧杆菌(bifidobactrium)末端常常分叉，因此得名 保加利亚乳杆菌肉食杆菌(Carnobacterium),2 乳酸菌的应用,乳酸菌是被人类作为食品微生物利用的一大类菌在增强牛奶保健功能、提高青贮品质、提高畜禽生产性能、降低畜产品贮藏对肉品风味的影响等方面已取得较好效果，广泛应用于食品、医药、轻工业和畜牧业等领域。目前在水产上主要集中于乳酸菌在水产动物肠胃和其他内脏器官中的栖息情况。乳酸菌在水产上的应用较多，主要是拌入饲料一起投喂给养殖动物，或做为EM菌的主导菌在水体泼洒。,3 乳酸菌的生理功能,乳酸菌在动物体内能发挥许多生理功能：3.1 维持微生态平衡，改善胃肠道功能 3.1.1乳酸菌是鱼肠道中的正常菌群，能在鱼肠道中定植，调节动物胃肠道正常菌群、维持微生态平衡；,维持微生态平衡的重要性,动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物。就其作用而言，可分为三类：共生性类型，主要是兼性厌氧菌，它们的维生素、蛋白质、消化酶合成、消化吸收、生物拮抗和免疫等功能对宿主有利。致病性类型，正常情况下数量少，寄生于正常部位，不至于使宿主发病。若失控，则会导致宿主的不良反应。中间性类型，即同时具有生理和致病两种作用，如大肠杆菌。,3.1.2 抑制病原菌生长,饵料或水体中的乳酸菌进入鱼消化道后能定植于肠道并大量繁殖,与消化道其它有益菌形成优势菌群,抑制致病菌的增殖。,（1）乳酸菌与病原菌争夺营养或附着位点，抑制病原菌生长。数量上占优势的乳酸菌会竞争消耗大量的营养,会抑制致病菌的增殖,乳酸菌的抑菌机理,乳酸菌的抑菌机理,乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合,在肠粘膜表面定植占位。当乳酸菌及其它有益菌成为肠道的优势菌群,可大量占据肠壁上的靶细胞,形成生物保护屏障,抑制病原菌对肠壁的定植，成为生理屏障的主要组成部分，从而达到恢复宿主抵抗力，修复肠道菌群屏障、治愈肠道疾病的作用。,乳酸菌的抑菌机理,相反，如果这个屏障遭到破坏，会使具有肠内治病菌异常增殖而取代优势益生菌的位置，造成肠道内微生态平衡的失调，宿主就丧失了对外来菌的抵抗力。,细菌在肠道内的定植,细菌在肠道内能否定植,决定于细菌细胞和肠粘膜的亲和力。细菌粘附是其定植并感染，致病的前提条件。病原菌依靠粘附素与肠粘液中相关受体的结合,在局部产生毒素或侵人深部组织致病。乳酸菌通过脂磷壁酸以及菌体分泌的表面蛋白对肠道粘膜细胞产生强大的粘附作用,与肠道厌氧菌共同形成生物屏障,阻止致病菌的入侵。,革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肤聚糖和磷壁酸组成,与粘附相关的主要是磷壁酸。一般认为,双歧杆菌是通过磷壁酸与粘膜上皮细胞结合而占据肠粘膜表面的对于乳杆菌来说,该属的多数菌种都具有表层蛋白,即S层蛋白，介导菌体与宿主的粘附。,乳酸菌对病原菌的定植抗力,所谓定植抗力,包括乳酸菌在内的内源性专性厌氧菌群限制肠道中条件致病菌数量的能力,发挥定植抗力作用的方式：与病原菌竞争粘附位点,抑制病原菌在肠道内定植；分泌胞外物质,阻止病原菌及毒素粘附于粘膜上皮；发生凝集反应,阻止病原菌的人侵感染；产生抑菌代谢物；竞争营养物质。,乳酸菌分泌抑菌物质抑制病原微生物增殖。乳酸菌能分泌乳酸、乙酸、其他形式的有机酸、细菌素、过氧化氢、乙醇和罗伊氏素等多种抑菌物质，但不同乳酸菌产生的抑菌物质有较大差别。,Vazquez等研究了九株乳酸菌对致病菌的抑制作用,结果表明乳酸菌主要通过分泌乳酸和乙酸抑制病原菌。Campos等报道,多株乳酸菌均通过产生细菌素抑制病原菌的生长。Vizoso等发现从人粪便和发酵产品上分离到的两株乳酸菌具有体外抑菌活性，并认为是乳酸菌产生的有机酸在起作用。Shahani等认为乳酸杆菌产生的复合物可以抑制其它微生物的生长，细菌素是最主要的，但过氧化氢、乳酸也有一定的作用。,乳酸无论是在体内还是在体外都可以对大肠杆菌等革兰氏阴性菌产生抑制作用，乳酸的积累导致周围环境pH值下降，降低氧化还原点位，可对许多革兰氏阳性或阴性细菌产生广泛的抑制作用。双歧杆菌在发酵过程中产生的乳酸是对潜在肠道致病菌和腐败菌拮抗作用的主要成分。,过氧化氢,乳酸菌产生的过氧化氢能够激活过氧化氢酶硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、假单孢菌属、大肠杆菌类、沙门氏菌属等。,乳酸菌素,乳酸菌在代谢过程中能合成并分泌到环境中的一大类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，称为乳酸菌素，主要可分为热稳定的小分子肽,大分子蛋白和羊毛硫抗生素。大部分细菌素对近缘关系的细菌有抑制作用,少数细菌素抑菌谱很广。可有效抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌的生长繁殖。而对革兰氏阴性菌起的作用不大,甚至不起作用。经添加EDTA或柠檬酸盐可以使乳酸菌素有效抑制革兰氏阴性菌。,尼生素 Nisin,由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus.Lactis.Subsp.Alctis)分泌的一种线型多肽,对革兰氏阳性菌(包括各种致病菌)有较广的抑制能力。是一种表面活性剂，作用于细菌膜，破坏、溃散、孔道化等。1933，WhiteheadHR等从乳酸菌分离出一类细菌素，在1947年将其命名为尼生素(Nisin)。1953，尼生素首先在英国上市，随后在48个国家开始利用尼生素，1988，尼生素通过美国FDA批准作为食品添加剂。,Hemandez等 将奶酪中分离到的植物乳杆菌进行抑菌研究，发现对许多革兰氏阳性菌有抑制作用，并确定抑菌物质是细菌素类物质，在pH值1-9内都具有很好的抑菌活性。,改变消化道pH 值。乳酸菌在代谢过程中产生乳酸、乙酸等有机酸,可降低消化道pH 值。因为多数致病菌难以在低pH 值环境中生长良好,因此乳酸菌造成的这种低pH 值环境能抑制病原菌的生长和繁殖。,3.2 免疫调节作用提高宿主机体的免疫力，增强抗感染能力：乳酸菌是良好的免疫激活剂 一方面由于它能在肠道定植，相当于天然自动免疫 另一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，刺激腹膜巨噬细胞诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等，所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应,提高机体的抗病能力。,日本海洋科技大学的一支研究小组2003年报道,饲喂鼠李糖乳酸杆菌后,虹鳟的多个免疫参数,如免疫球蛋白水平、血细胞呼吸爆发活性、吞噬活性和补体活性等显著上升,而且活菌制剂的免疫增强效果要明显优于死亡的乳酸菌制剂。该研究小组最新的研究表明,饲喂鼠李糖乳酸杆菌不仅可刺激虹鳟多个免疫参数上升,还可上调脾和头肾的白介素-1、肿瘤坏死因子1和2、转化生长因子的相对基因表达。,Pergidon等(1988)报道，口服乳酸菌后，对巨噬细胞的-半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作用。Chandra(1984)认为，乳酸菌之所以具有刺激机体产生抗体的作用，是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细胞,接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结(MLN)循环到血流中，并分布全身，从而调节机体的免疫应答。,3.3 补充营养物质,改善机体代谢乳酸菌的菌体本身就含有大量的营养物质,如蛋白质、维生素（乳酸杆菌能合成动物所需要的多种维生素如B1、B2、B6、B12、烟酸、泛酸、叶酸等）以及钙、磷等多种微量元素、辅酶Q、氨基酸、胆盐等。益生菌还能产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多种消化酶,协助动物消化饵料，提高食物消化率和生物效价。,3.4 降解动物体内亚硝酸胺、氨、粪臭素等 有害物质，,4 乳酸菌对水产养殖环境的适应性,乳酸菌在水产动物体内的定植状况 乳酸菌作为鱼类益生菌，在肠道内具有较好的定植能力，而且在水产动物中，这种定植无明显的宿主特异性。,Ringoe应用从大西洋鲑分离的广布肉杆菌，研究在大菱鲆幼鱼肠道内的定植时，证明了这一点。王福强等研究表明，来源不同的鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌均可在牙鲆消化道定植，乳酸杆菌定植和对弧菌产生抑制作用的主要部位在小肠。,Rengpipat等用Bacillus11养殖斑节对虾抑制了水中弧菌数量的增长。陈营研究表明，通过在饲料中添加由单一鼠李糖乳杆菌P15制备的微生态制剂，证明鼠李糖乳杆菌P15可以在牙鲆仔稚鱼肠道中定植，并能控制肠道中的弧菌数量。,5水产养殖环境对乳酸菌的影响,5.1 环境因素一般水产养殖在养成期间环境的温度、盐度和pH值的变动范围分别为20-35和0-38、6.9-8.7。有研究表明，乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对水产养殖环境有很好的适应性。乳酸杆菌生长的最适温度为30-40，在溶解氧高或低的条件下都能很好生长，也进行厌氧生活。在池塘养殖水体中，中下层水的溶解氧一般较低，病原菌容易滋生，如在其中投入乳酸杆菌使其成为优势菌，可抑制病原菌的繁殖。,5.2 水产养殖常用抗菌药物和消毒剂对乳酸菌的影响,各种有益菌对不同抗菌药物的敏感性不一利用有益菌来抑制病原菌，预防病害发生现已成为一个新的研究热点，在生产中的应用也日益广泛，但利用药物来预防和治疗疾病仍是最主要的手段。各种有益菌对不同抗菌药物的敏感性不一，同一种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也常存有差异，因此在应用上要考虑菌对药物的敏感性，以达到最佳的使用效果。,李平兰等就微生态制剂中5种乳酸菌对抗生素的敏感性进行了研究，结果表明长双歧杆菌(B.longum)、外嗜酸乳杆菌(L.acidophitus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌(L.case)和粪肠球菌(E.faecalis)对头孢素类、青霉素类、-内酰胺酶抑制剂复合物中的某些抗生素均表现了一定的耐药性，而5种乳酸菌对四环素类抗生素和大环内酯类抗生素都敏感,马艳等发现乳酸菌1菌株对盐酸林可霉素、庆大霉素敏感，而对丁胺卡那霉素不敏感，并发现复合益生菌可以改变抗生素对单株菌的最低抑菌浓度，降低单株菌对某些抗生素的敏感性。,对消毒剂敏感周海平通过乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对氟苯尼考、土霉素、二氧化氯、二溴海因、强力碘的敏感性实验结果显示，这些药物对菌有一定的抑制作用。,6、乳酸菌的应用实例,由于抗生素、激素类药物在水产上的不合理使用，导致农药残留问题对人类健康造成了巨大威胁。水产养殖领域，人们越来越提倡生态养殖、健康养殖。,美国在FDA(1989)规定的40多种饲用微生物中有近30种是乳酸菌。我国农业部在1994年批准使用的微生物品种有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳链球菌等，其中大部分为乳酸菌。乳酸菌耐酸，在pH为3.0-4.5时仍可生长，能适应胃肠内的酸性条件，饲喂后能在水产动物体内迅速定植，因此无疑是一种理想的微生物制剂。,6.1抑制病原菌、抗病害,乳酸菌能有效调整水产动物肠道的菌群平衡，通过营养竞争、附着位点竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素杀死或抑制病原微生物，增强抗感染能力，调节机体肠粘膜的免疫活性，提高动物在遭受病害侵袭时的存活率。实践证明应用乳酸菌防治水生动物疾病是可行的。,陈营等从健康牙鲆肠道中分离得到多种乳酸菌，且体外实验表明对弧菌均有抑制作用。周海平为探明乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对水产养殖病害的生物防治功能，采用试管稀释法和平板抑菌圈检测法，探讨了乳酸杆菌代谢产物对沙蚕弧菌(Vibrionereis)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、漂浮弧菌(Vibrionatriegen)的抑制能力，结果表明：乳酸杆菌对病原弧菌具有良好的抑制作用。Jiravanichpaisal等报道了乳酸杆菌作为有益菌可以用来防止由发光细菌感染造成的斑节对虾的白点病。,杨莺莺等研究乳酸杆菌L1对致病弧菌的抑制作用，证明乳酸杆菌及代谢物质对鲨鱼弧菌和溶藻弧菌具有协同抑制作用。杨勇等证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，该代谢产物对鳗弧菌的抑制效率在90%以上。,姜英辉等研究了乳酸链球菌L3-18的培养及其对海洋弧菌的抑制作用。窦晓明就乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究表明，3株乳酸菌（命名为A-1，A-2，A-3）胞外产物对副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)有较强的抑制作用。,6.2促进生长，提高抗病力、免疫力,乳酸菌能分泌乳酸，产生多种消化酶，可帮助鱼类消化吸收，促进生长。Byurl等从鲆鱼分离并筛选出一菌株Lactobacillussp.DS-12，它表现出强的抗菌活性，能抑制多种鱼体病原菌（如鳗弧菌、嗜水气单胞菌等）的生长，在2次各为期1个月的饲喂实验中，他们发现饲喂含有DS-12菌株的试验组，鱼的平均体重的增加均比对照组的快，揭示了乳酸菌同时拥有既抑菌又促生长的双重机能。,Gildberg等用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。用保加利亚乳酸杆菌饲养轮虫与卤虫后作为大菱鲆幼鱼的饵料，可使轮虫和卤虫的存活率显著提高。Gatesoupe利用乳酸菌饲养的轮虫作为大菱鲆仔鱼的鲜活饵料，证明乳酸菌可以提高仔鱼对病原弧菌的抵抗力。Nikoskelainent等研究表明，给虹鳟投喂含有乳酸杆菌的饵料，可以提高它们的免疫力。桂远明等报道乳酸菌等微生物制剂对鲤具有促生长和提高抗病力作用。,6.3净化养殖水体,向养殖水体投放有益菌（光合细菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等）及有益酶（蛋白分解酶、纤维素酶、植酸酶等）的复合制剂，不仅促进饵料生物大量繁殖、生长，而且可分解鱼类残饵、粪便及水中有机质，改良水体环境，抑制水体中有害菌的繁殖生长，调节藻相平衡，控制有害菌藻。,使用以乳酸菌为主的微生态制剂，可以有效降低水中的亚硝酸盐含量；而芽孢杆菌对于水体中氨态氮和有机物的分解作用比较明显，可降低水体中氨态氮、亚硝酸盐的含量，避免了传统肥料高耗氧、破坏和污染水质、高发病率的缺点。所以乳酸菌可与芽孢杆菌、光合细菌、反硝化菌等有益菌混合使用，作为养殖水体的水质调控剂，改善水中生态环境，净化水质，促进鱼虾类健康生长,周海平 就乳酸杆菌对养殖水体，饲料的降解作用进行了深入研究，结果表明：各实验组中的NO2-N、NO3-N、PO43-P从实验第1天到第4天一直处于下降趋势，而NH4+-N呈上升趋势，对COD无降解能力，温度、菌浓度、底物浓度对NO2-N、NO3-N、PO43-P、NH4+-N降解率的影响是极其显著的。,沈南南 研究了地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis，BL)、光合细菌(PSB)和乳酸杆菌(Lactobacillusspp.)对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)封闭式高密度养殖水质的调控效果，结果表明，芽孢杆菌结合乳酸杆菌使用，可以明显降低养殖水体氨氮等有害物质的含量。,EM是由多种有益微生物组成的活菌制剂，在水产养殖上既可用作水质净化、改良剂，保持水质稳定，又可作为饵料拌合剂，增强养殖品种的免疫力，促进养殖品种的健康生长，从而提高产量和效益。,乳酸菌作为EM菌的主导菌应用于水质净化的效果良好。白维东在成鱼养殖池中使用EM菌，实验池溶氧量比对照池提高11.2%，NH4+-N和NO2-N含量分别降低了54%、55%，饵料系数降低8.2%，单位面积净产量提高14.4%。黄永春报道EM制剂能降低建鲤养殖池氨氮。林新华等研究表明，经复合EM处理后能使养殖水体达到无污染排放。,7应用前景,从目前的研究报道来看，乳酸菌对动物免疫有多方面的调节作用，能显著提高机体的免疫功能，尤其是在对病原菌的定植拮抗方面，这使对乳酸菌等益生菌研究成为当今生物技术的热门课题之一。作为最有前途的抗生素替代品，乳酸菌正以其独特的优势影响着医药、食品、畜牧等多种产业的发展。,乳酸菌在水产养殖中的应用前景是诱人的，完全有可能取代目前所用的抗生素、化学促生素，成为21世纪人们所接受的绿色微生物制剂。,由于单一使用某一微生物都存在一些缺点，现在许多学者和生产厂家在试图利用不同菌株的不同特性，将多种微生物培育后复合为复合微生态制剂，以期发挥它们的综合作用。随着对其作用机制研究的不断深入，以及人们对绿色环保意识的不断增强，乳酸菌的应用前景会更加广阔。,8 鱼类消化道乳酸菌的分布,仔稚鱼鱼卵孵化前表面附着有大量的细菌,但刚孵化鱼的胃肠道通常是无菌的,孵化后由于与环境和饲料的接触,一些能适应鱼类胃肠道环境,如胃肠道pH 值、厌氧环境、胆盐和消化酶以及宿主的免疫系统的微生物开始陆续定植于胃肠道,逐渐形成比较复杂而稳定的微生物区系。,乳酸菌是早期恒温动物消化道的优势菌,但研究表明仔稚鱼消化道中也存在一定数量的乳酸菌,淡水鱼肠道乳酸菌也是肠道正常菌群的主要组成成分,海水鱼类肠道中乳酸菌先后从鲱和鳕、斜带石斑鱼幼鱼肠道粘膜上分离到乳酸菌。,幼鱼鱼类的消化系统到幼鱼期基本发育完全,通常包括食道、胃、幽门盲肠、小肠和大肠等几个部分。R ingo 从北极嘉鱼胃内分离到了各种细菌,乳酸菌占这些细菌总量约为10%。Seppo la等研究大西洋鲑幼鱼后肠腔和大肠的细菌组成,后肠腔的细菌均为肉杆菌,大肠的细菌中肉杆菌占10%。,成鱼,Ringo 等的研究表明肉杆菌是北极嘉鱼肠道的固有菌群,是北极嘉鱼对抗致病菌定植的天然菌群屏障的重要组成部分。多数研究表明,从前到后鱼类各段消化道附着的微生物数量呈逐渐上升趋势,谢 谢！,