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a1,3,5(Col-IV)免疫荧光染色及其应用,复旦大学附属儿科医院病理科,Col-IV胶原分子在体内的分布,IV胶原合成或降解障碍,Col-IV型胶原的分子结构与分布,Type IV collagen chains form 3 forms of heterotrimeric units in basement membranes:a1a1a2,a3a4a5 and a5a5a6,Col-IV型胶原的分子结构与分布,3,3,3,COL4A6,COL4A1,COL4A4,COL4A3,COL4A2,COL4A5,5,5,5,5,5,5,130 pb,450 pb,3,3,3,Xq22,2q35,13q34,Schematic representation of the distribution of type IV collagen gene on chromosomes 13,2 and X,Type IV collagen family comprises six distinct chains a1(IV)to a6(IV)encoded by six genes(COL4A1COL4A6)Type IV collagen chains form 3 forms of heterotrimeric units in basement membranes:a1a1a2,a3a4a5 and a5a5a6 a3a4a5 type IV collagen network predominates in GBM,1-1-2-所有器官的 BM,3-4-5-分布于GBM LBM 眼 耳,5-5-6 皮肤 血管 BM,1、2 链 TBM、肾球囊壁BM、小球MeS和GBM 3、4、5 链 GBM、DTBM 6 链 肾球囊壁 BM、CTBM,a1,3,5(Col-IV)在肾组织表达,a1,3,5(IV)荧光染色方法,荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）fluoresceinisothiocyanate,FITC,495nm 2、罗丹明（红色荧光）Lissamine rhodamine B,RB200,3、R藻红蛋白 R-pheoerythin,R-PE,直接法：1，3（）,免疫荧光技术,切片滴加一抗抗置于37恒温箱孵育1h 70%甘油（甘油：PBS=7:3）封片。,免疫荧光技术,间接法：5(IV),a5加修复液10mins（0.1MKCL+0.1MHCL等比例混合）滴加一抗孵育过夜，PBS洗约5mins滴加二抗置于37恒温箱孵育1h 70%甘油（甘油：PBS=7:3）封片。,1,3,5,1 TBM、球囊壁BM、MeR、GBM；3,5 链 GBM.DTBM,3,Euro-Diagnostic Co 的 Alport S Kit的染色结果评判 Normal Alport dominant Alport recessive kidney skin kidney skin kidney skin MAB1+MAB3+-MAB5+-+,用于遗传性肾小球基膜病的诊断,Hematuria,Proteinuria,a3b1-integrin,a-actinin-4,agb3-integrin,uPAR,Paxilin,Glepp1,Podocalyxin,Nherf2,Ezrin,Actin cytoskeleton,a-actinin-4,Synaptopodin,Vinculin,Talin,ILK,CD151,ab-dystroglycan,Utrophin,Vitronectin,Agrin,Laminin,Collagen IV(a3,a4,a5),Slit-Diaphragm complex,GBM,GBM的主要成分是IV型胶原.层连蛋白.蛋白多糖和巢蛋白,1,2,3,4,5,6,G,H,I,注：正常人:GI中 2(红)；5（绿）,遗传性肾小球基膜病,TYPE IV COLLAGEN TRIPLE HELIX STRUCTURE,MOLECULAR DEFECT,PHENOTYPE,a5(IV)a3(IV)a4(IV),a3(IV)a4(IV),a5(IV)a3(IV)a4(IV),a5(IV)a4(IV),a5(IV)a3(IV),a5(IV)a3(IV)a4(IV),a5(IV)a3(IV)a4(IV),a5(IV)a3(IV)a4(IV),1 COL4A5 XmY,1 COL4A5 XmX,2 COL4A3,2 COL4A4,1 COL4A3,1 COL4A4,NONE,1 COL4A31 COL4A4,Normal GBM,X-LAS affected maleEarly onset ESRD,X-LAS carrier femaleVariable outcome,ARAS affectedEarly onset ESRD,ADASVariable outcome,Torra R et al NDT 2004,TBMD,常染色体隐性遗传的Alport患者,X-连锁的 Alport患者,X-连锁的Alport 女性携带者,Collagen a5(IV)staining,皮肤活检的 5(IV)的荧光染色,常染色体隐性遗传 Alport S,X-染色体连锁-Alport S 女性携带者,X-染色体连锁的Alport S,Alport 综合征,一组以GBM病变为病理特征,临床表现间歇性血尿，进行性肾功能减退的遗传性疾病 遗传方式：XLAS ARAS ADAS,临床特征,a发病年龄 约 5岁起病，偶在婴儿期 b症状 间歇性血尿，（镜下为主）时有发作性肉眼血尿 时有脓尿 少有 NS 晚期肾功能降低 c伴随症状：神经性耳聋多见（50%）,病 例 示 范,病例1.K 13-105(E-1047)袭俊杰,男,8y,病史:反复肉眼血尿5y余,拟诊“MsPGN”;荧光：各指标均(-);ColIV1(+)，ColIV3(-)，ColIV5(-).诊断：局灶节段硬化性肾炎，结合临床，考虑Alport S.,1,3,5,PAS,EM:GBM厚薄不均、致密层呈分裂状,EM:GBM 增厚、致密层呈稀疏空泡状,EM:GBM 内有少量致蜜物（D）沉积,D,最后诊断:符合 Alport S,病例2.K15-15(E0068).张宗能,男,3岁,病史:尿色异常2w,尿检异常近1w,有血尿 家族史;荧光:Fb(),余(-）;ColIV1(+)，ColIV3(-)，ColIV5(-)诊断:考虑Alport 综合征,1,3,5,EM:GBM 厚薄不均,部分甚薄，伴足突消失,EM:GBM 局部增厚,致密层结构紊乱、略呈空泡状,EM:GBM 厚薄不均、致密层结构疏松、多层状,最后诊断:Alport S,薄基膜肾病(thin basement membrane nephropathy，TBMN),又名:薄基膜综合征（thin basement membrane syndrome）良性家族性血尿（benign familial hematuria）(1966年报道)病因和发病机制 原发性者病因不明，多数为父子间传递的常染色体显性遗传;少数为常染色体隐性遗传（Col4A4 基因突变）Alport 病 的杂合子;也可能是不伴耳聋的遗传性肾炎或经典的Alport 综合征;部分儿童或女性散发性血尿者,可能是 Alport 综合征的早 期表现。,临床特征持续性无症状血尿，镜下型多见可伴轻度蛋白尿,病 例 示 范,病例3.K 13-75(E-0844)韩天,男,8y，病史：镜下血尿11d.荧光：各指标均(-);诊断：肾小球ML，待电镜证实是否为 TBMD。,PAS,TBMD(x3000),MCD(x2000),最后诊断:TBMD,病例4.K14-82,钱奕晗,男,8y,病史：血尿待查,Alport S？荧光:各指标均(-);ColIV1(+)，ColIV3(+)，ColIV5(+)诊断:肾小球轻微病变，待电镜证实是否 为TBMD.,1,3,5,PAS,EM:GBM 弥漫性变薄(2m)，足突未见消失,EM:GBM 弥漫性变薄(2m)，足突少量消失、假 绒毛形成,最后诊断:TBMD,病例5。K14-105(0814)郑嘉睿,女,7岁,无锡市儿童医院 病史：拟诊“血尿”待查;荧光:各指标均(-);ColIV1(+)，ColIV3(+)，ColIV5(+)诊断:肾小球轻微病变，待电镜证实是否为 TBMD,1,3,5,Masson,EM:GBM 变薄，足突结构细长，未见消失,最后诊断:TBMD,总 结,a(Col-IV)有着不同的遗传方式和性别特征性分布规律a 1,3,a 5(IV)荧光免疫检查是诊断AS的重要指标a 1,3,a 5(IV)荧光免疫检查可以协助判断AS的遗传方式皮肤a5(IV)免疫荧光检查可以作为XDAS的筛查,THANKS!,