蛋白质组学研究技术.ppt

2023年2月28日星期二,1,蛋白质组学研究技术,2023年2月28日星期二,2,第一节 概述,1985年由贝尔杜科等提出，1990年正式启动并于2003年学成的人类基因组计划使生命科学的研究进入了后基因组时代。,蛋白质组学的产生,2023年2月28日星期二,3,第一节 概述,蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。,2023年2月28日星期二,4,第一节 概述,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）,2023年2月28日星期二,5,第一节 概述,美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。,2023年2月28日星期二,6,第一节 概述,英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,2023年2月28日星期二,7,第一节 概述,Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,2023年2月28日星期二,8,第一节 概述,1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,2023年2月28日星期二,9,第一节 概述,我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会,2023年2月28日星期二,10,第一节 概述,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,2023年2月28日星期二,11,第一节 概述,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,2023年2月28日星期二,12,第一节 概述,蛋白质组的概念：,1995年，由Wasinger等在Wlectrophoresis中定义为一个基因组编码的全部蛋白质。,1977年，在Williams和Wilkins有关蛋白质组研究的专著ProteomeResearch:New frontiers in Functional Genomics中定义为一个基因组或组织所表达的全部蛋白质。,1999年进一步定义为一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。,2023年2月28日星期二,13,第一节 概述,蛋白质组是：,1、对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。2、同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。3、在空间和时间上动态变化着的整体。,2023年2月28日星期二,14,第一节 概述,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,2023年2月28日星期二,15,荧光染色的细胞内蛋白质,2023年2月28日星期二,16,第一节 概述,与单一蛋白质研究比较，蛋白质组学的特点是：,蛋白质组学采用高通量和大规模的研究手段，在研究有关生命活动机制的基本规律方面达到了空前的规模和速度。最终目标：构建出细胞的“功能图”,2023年2月28日星期二,17,第一节 概述,与基因组比较，蛋白质组学的特点是：,2023年2月28日星期二,18,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,2023年2月28日星期二,19,第一节 概述,蛋白质组学研究的意义,Genome-导演RNome-编剧Proteome-演员,2023年2月28日星期二,20,Central dogma,2023年2月28日星期二,21,mRNA水平的基因表达研究取得进展，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.40.5，mRNA的种类与含量不能代表蛋白质的种类与含量。支原体的蛋白质数目较基因多24%，对于人，蛋白质的数目至少多3倍。蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到解答：复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质蛋白质相互作用等,基因与其编码产物蛋白的非线性关系,第一节 概述,2023年2月28日星期二,22,第一节 概述,蛋白质组学研究范围及意义,表达蛋白质组学研究 选择具有重要生物学意义且已完成DNA测序的生物体，鉴定出生物体/某种组织（细胞）所表达的全部蛋白质，建立其蛋白质表达谱数据库。进展较快的领域：一些重要的疾病及微生物组。有难度的领域：估计人类的蛋白质组由50万个蛋白质组成，真核生物细胞表达的蛋白质也超出1万个,2023年2月28日星期二,23,第一节 概述,功能蛋白质组学研究 识别、鉴定生物体（组织，细胞）与某一种生理现象或病理过程相关的所有蛋白质。,重要生命过程或重要疾病的比较蛋白质组学 选取重大生命活动或重要疾病中几个相继阶段，识别、鉴定其差异表达的蛋白质，然后从核酸、蛋白质水平对差异蛋白的功能进行分析，从而确定重要生命活动的蛋白质基础或疾病的生物标志物。,2023年2月28日星期二,24,第一节 概述,亚细胞复合物和细胞器蛋白质组分析 了解蛋白质的功能和细胞 定位。识别、鉴定蛋白质翻译后的修饰。药物靶标的发现 蛋白质不仅是多种致病因子作用于机体的重要靶分子，也是大多数药物的靶标。一项统计表明：20世纪90年代中期，全世界制药业用于寻找新药的靶标483个，其中蛋白质占73%，而当时正在使用的药物共2000种，其中85%都是针对483种药靶。,2023年2月28日星期二,25,2023年2月28日星期二,26,第一节 概述,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,2023年2月28日星期二,27,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学的三大支撑技术,分离技术：双向电泳技术鉴定技术：质谱技术生物信息学：计算机图像分析与大规模数据处理技术,2023年2月28日星期二,28,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学的三大支撑技术,分离技术：双向电泳技术鉴定技术：质谱技术生物信息学：计算机图像分析与大规模数据处理技术,2023年2月28日星期二,29,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质组学两条互补的技术流程,两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow）基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）,2023年2月28日星期二,30,蛋白质组研究的技术路线流程图,2023年2月28日星期二,31,2023年2月28日星期二,32,蛋白质组学实验室所需的条件,2023年2月28日星期二,33,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,双向电泳Two Dimensional Electrophoresis,2023年2月28日星期二,34,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,二维凝胶电泳（2-DE）目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术工作原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和分子量的特异性，将蛋白质混合物通过等电聚焦电泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在两个水平上进行分离。1975年首先由OFarrell等创立,2023年2月28日星期二,35,2023年2月28日星期二,36,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特 点：,1、可分离10100 KDa分子量的蛋 白质 2、高灵敏度和高分辨率3、重复性高4、便于计算机进行图像分析处理 5、与质谱分析匹配,2023年2月28日星期二,37,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,重复性高的技术前提：,1、样品制备的重现性2、等电聚胶的pH梯度的稳定性及重现性3、一向胶条与二向胶之间的接触是否良好4、二向聚丙的聚合均匀程度及重现度5、凝胶显色方法的选择及显色时间的控制实验人员的操作技能,2023年2月28日星期二,38,2D-SDS-PAGE重复性,2023年2月28日星期二,39,2023年2月28日星期二,40,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,1、样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,2023年2月28日星期二,41,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,过程1）收集生物样品2）破碎3）抽提,2023年2月28日星期二,42,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,抽提蛋白质常用到的试剂1）去污剂，有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离2）还原剂，用于还原二硫键或防止蛋白质氧化3）变性剂，用于改变溶液离子强度和PH，破坏蛋白质-蛋白质相互作用，破坏蛋白质的二级结构和三级结构。4）酶，用于消化污染的核酸、糖和脂类。,2023年2月28日星期二,43,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,可能干扰蛋白质组分析的某些试剂 1）苯甲基黄酰氟 2）去污剂,2023年2月28日星期二,44,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,2023年2月28日星期二,45,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,分步提取法采用三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞总蛋白质组分，然后分别进行双向电泳分离。各步提取液：40mmol/L Tris-base；8m/L尿素、4%CHAPS、100mmol/L DTT、40mmol/L Tris-base、0.5%的两性电解质；5m/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、2%SB3-10、2mmol/L TBP、40mmol/L Tris-base、0.5%的两性电解质。,2023年2月28日星期二,46,2023年2月28日星期二,47,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,2、等电聚焦OFarrell系统：小分子载体两性电解质形成pH梯度。当电压加在载体两性电解质混合物间时，高pI的分子移向阴极，低pI的分子移向阳极，形成一个连续的pH梯度。缺陷 梯度胶稳定性差，电泳时易因电渗而出现阴性漂移,2023年2月28日星期二,48,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度在凝胶聚合时形成而不随环境电场条件的改变而改变，固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。,2023年2月28日星期二,49,2023年2月28日星期二,50,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,IPG优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。重现性好上样量大,2023年2月28日星期二,51,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,3.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第二相的分子量分离：制胶；IPG胶在SDS平衡液中还原和烷基化；第一向胶成分移至第二向胶上；电泳；蛋白检测,2023年2月28日星期二,52,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,IPG胶在SDS平衡液中还原和烷基化平衡液：使胶条上的蛋白质变性，破环蛋白质的高级结构及亚基间相互作用SDS:阴离子去污剂，1mmol/L,结合使蛋白带负电荷过量，在电场作用下，迁移速率主要有分子量决定尿素、还原剂（DTT）、烷化剂（IAA）,2023年2月28日星期二,53,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,第一向胶成分移至第二向胶上最关键步骤注意事项：第一向胶和第二向胶接触好：避免引入气泡，封胶均匀：避免二向电泳时胶条的移动SDS-PAGE电泳,2023年2月28日星期二,54,2023年2月28日星期二,55,2023年2月28日星期二,56,2023年2月28日星期二,57,Ettan Dalt twelve电泳系统,2023年2月28日星期二,58,Ettan Dalt six电泳系统,2023年2月28日星期二,59,2023年2月28日星期二,60,2023年2月28日星期二,61,可能原因：样品含高丰度Pr,可能原因：TCA残留致使Pr丢失,2023年2月28日星期二,62,可能原因：Tris质量不好,可能原因：Urea 不纯,2023年2月28日星期二,63,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,蛋白检测检测某种蛋白是否存在用Western blotting进行分析；显示蛋白质全谱时多用银染色法检测，或用灵敏度较高的荧光标记与同位素标记检测；当双向电泳蛋白分离后紧跟质谱鉴定时，多用考马斯亮兰R-250、Cu染或Zn-咪唑负性染色法。,2023年2月28日星期二,64,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,图像分析系统图像采集硬件和图像分析软件Melanie 3、PDQuest 6.0、Imagemaster 2D Elit3.10等基本功能 确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、数据库分析等内容。,2023年2月28日星期二,65,Image Scanner,2023年2月28日星期二,66,全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）,2023年2月28日星期二,67,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,新型非凝胶分离技术液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳capillary electrophoresis，CE,2023年2月28日星期二,68,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,生物质谱与蛋白质鉴定,2023年2月28日星期二,69,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,蛋白质的鉴定方法主要利用蛋白质的各种属性参数，如分子量、等电点、序列、氨基酸组成和肽质量指纹谱等，在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。如果在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋白，进一步要进行序列分析，合成探针，分离相应基因来表达，进一步鉴定这一蛋白质生物质谱技术在蛋白质组鉴定中起非常重要的作用,2023年2月28日星期二,70,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质谱仪的发展简史 1912年：世界第一台质谱装置 1940年代:质谱仪用于同位素测定 1950年代：MS商品化广泛用于有机物结构分析 1960年代：研究GC-MS联用技术 1980年代：研究LC-MS联用技术 1990年代：生物分析的需要，新的离子化方法,2023年2月28日星期二,71,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,生物质谱技术质谱分析法是通过测定样品离子的质量与电荷比值-质荷比(mass/charge，m/z)来进行未知化合物的成分和结构分析的分析方法。质谱分析所获得的结果即离子的相对含量与质荷比之间的关系图就称为质谱图（亦称质谱）,2023年2月28日星期二,72,2023年2月28日星期二,73,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质谱法的特点,1、信息量大，应用范围广，是研究有机化学和结构的有力工具。,2、由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息，所以质谱法也是测定分子量的常用方法。,3、分析速度快、灵敏度高、高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定。,4、质谱仪器较为精密，价格较贵，工作环境要求较高，给普及带来一定的限制。,2023年2月28日星期二,74,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质谱能够提供的信息：相对分子质量低分辨质谱就可以确定相对分子质量，高分辨质谱可精确到0.0001；分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量,均可以确定分子式；,2023年2月28日星期二,75,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,鉴定某些官能团如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43)分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z及相对丰度RA提供分子结构信息；人机问答，给出可能的化合物。,2023年2月28日星期二,76,2023年2月28日星期二,77,Source,HexapolePre-filter,Q1Mass Filter,Detector+/-ions,Q3Mass Filter,Q2 semi-circularCollision Cell,250 l/sTurbo,Interlock,2023年2月28日星期二,78,质谱分析原理,2023年2月28日星期二,79,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,离子源离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。质谱仪的离子源种类很多:,2023年2月28日星期二,80,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,1、电子电离源(Electron Ionization，EI)2、化学电离源(Chemical Ionization,CI)。3、快原子轰击源（Fast Atomic bombardment,FAB）4电喷雾源(Electron spray Ionization，ESI)5大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization,APCI),2023年2月28日星期二,81,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质谱仪的分类按用途分：有机质谱；无机质谱；同位素质谱按原理分：单聚焦质谱；双聚焦质谱；四极质谱；飞行时间质谱；回旋共振质谱按联用方式分：气质联用；液质联用；质质联用,2023年2月28日星期二,82,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质谱分析法原理 将样品转化为运动的带电气态离子碎片，然后按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法,2023年2月28日星期二,83,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,仪器组成按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳定电磁场(单聚焦及双聚焦质谱仪)和变化电磁场(飞行时间和四极杆质谱仪)MS仪器一般由真空系统、进样系统、电离源、质量分析器和检测系统构成,2023年2月28日星期二,84,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,真空系统质谱仪中所有部分均要处高度真空的条件下(10-4-10-6Pa),其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：a)大量氧会烧坏离子源灯丝b)引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化c)干扰离子源正常调节d)用作加速离子的几千伏高压会引起放电,2023年2月28日星期二,85,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,一般质谱仪都采用机械泵预抽空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度,2023年2月28日星期二,86,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,进样系统对进样系统的要求：重复性、不引起真空度降低（1）间接进样 适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。注入样品(10-100g)贮样器(1-3L)抽真空(1Pa)并加热到15000C样品蒸汽分子(压力梯度)漏隙高真空离子源,2023年2月28日星期二,87,2023年2月28日星期二,88,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,（2）直接探针进样适于高沸点液体及固体样品 探针杆通常是一根规格为25cm6mmi.d.,前端有一容纳样品的陶瓷小凹槽，当探针插入或拉出时，斜置的封闭阀就可将真空体系与外界大气隔绝，通电发热，使样品蒸发，对热稳定的有机化合物一般可加热到20030000C而不分解，通常可分析非极性分子的分子量可达1000u，中等极性分子量达300u,2023年2月28日星期二,89,2023年2月28日星期二,90,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,优点：1)引入样品量小，样品蒸汽压可以很低2)可以分析复杂有机物3)应用更广泛,2023年2月28日星期二,91,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,（3）色谱进样：利用气相和液相色谱的分离能力，进行多组份复杂混合物分析,2023年2月28日星期二,92,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,3 电离源(室)将引入的样品转化为正离子，并使之加速，聚焦为离子束的装置。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法,2023年2月28日星期二,93,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：气相源：先蒸发再激发，适于沸点低于500oC、对热稳定的样品的离子化，包括电子轰击源、化学电离源、场电离源、火花源解吸源：固态或液态样品不需要挥发而直接被转化为气相，适用于分子量高达105的非挥发性或热不稳定性样品的离子化。包括场解吸源、快原子轰击源、激光解吸源、离子喷雾源和大气压化学（热喷雾）电离源 等,2023年2月28日星期二,94,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,硬源：离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息，如电子轰击，快原子轰击软源：离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量信息，如化学电离源，场电离源，场解吸电离源，激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学（热喷雾）电离源,2023年2月28日星期二,95,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,（1）电子轰击源（EI）电子轰击法是通用的电离法，是使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子，即 M+e M+2e 式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子,2023年2月28日星期二,96,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,水平方向：加热灯丝与阳极间(加直流电压70V)高能电子束冲击样品正离子垂直方向：G3-G4加速电极(低电压)-较小动能-狭缝准直G4-G5加速电极(高电压)-较高动能-狭缝进一步准直-离子进入质量分析器,2023年2月28日星期二,97,2023年2月28日星期二,98,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,EI特点1 使用最广泛，谱库最完整2 电离效率高3 结构简单，操作方便4 分子离子峰很弱或不出现：因为电子能量高达70 eV，而大多数有机化合物的电离电位约为7-10 eV，因此除生成分子离子外，还要进一步断裂成碎片离子，约有10-20%的有机化合物（相对质量较大，极性大，难气化，热稳定性差的化合物）电离时缺少分子离子峰,2023年2月28日星期二,99,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,（2）化学电离源(CI)原理：高能量的电子轰击反应气体使之电离，电离后的反应分子再与试样分子碰撞发生分子离子反应形成准分子离子和少数碎片离子 作用过程：样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气(通常是甲烷)稀释，稀释比例约为103:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的分子离子主要由反应气分子组成,47,41,2023年2月28日星期二,100,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,进入电离源的样品分子R-CH3大部分与CH5+碰撞产生(M+1)+离子；小部分与C2H5+反应，生成(M-1)+离子；极微小部分发生复合反应：,2023年2月28日星期二,101,这样就形成了一系列准分子离子QM+而出现(M+1)+，(M-1)+，(M+17)+，(M+29)+等质谱峰,产生M+1峰,质子化反应,复合反应,2023年2月28日星期二,102,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,CI特点：1 准分子离子峰即(M+1)+峰很强，可提供相对分子质量这一重要信息，从而可以推断出相对分子质量 2 碎片峰较少，谱图简单，因为电离样品分子的不是高能电子流，而是能量较低的二次离子，键断裂的可能性较小，峰的数目随之减少3 使用CI时需要将试样气化后进入离子源，因此不适用于难挥发，热不稳定或极性较大的有机物分析,2023年2月28日星期二,103,（3）场电离源(FI),应用强电场(电压梯度107-108V/cm)诱导样品电离,过程：强电场分子电子的量子隧道效应*分子热分解或碰撞带正电荷的碎片离子阳极排斥出并加速进入质量分析器,r2.5m,1mm,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,2023年2月28日星期二,104,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,量子隧道效应：就是依靠强电场(10-7-10-8Vcm-1)把尖端附近纳米处的分子中的电子拉出来，或者说电子在强电场作用下要由阴极向阳极移动，从而脱离样品分子，形成正离子电极要求：电极为一尖锐的叶片或金属丝（曲率半径2.5m），其上长满微针，故称金属胡须发射器。使用微碳针(1m，W丝上的苯基腈裂解生成)构成多尖陈列电极可提高电离效率,2023年2月28日星期二,105,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,FI特点：场致电离源的能量约为12eV，因此分子离子峰强度很大，也很清楚，碎片峰较少也较弱，利于相对分子质量的测定，缺乏分子结构信息,2023年2月28日星期二,106,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,场解吸源(FD)类似于场电离源，它也有一个表面长满“胡须”(长0.01mm)的阳极发射器(Emitter)过程：样品溶液涂于发射器表面通电加热蒸发除溶剂解吸样品分子强电场分子电离奔向阴极引入质量分析器 特点：特别适于非挥发性且分子量高的样品，谱图最为简单（解吸所需的能量远低于气化所需的能量，所以有机化合物不会发生热分解）；离子源的工作温度略高于室温，分子离子几乎不具有过剩的能量，因此基本上不断裂，分子离子峰的强度比FI强,2023年2月28日星期二,107,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,火花源(Spark)针对金属合金或离子残渣样品等非挥发性无机物的分析，类似于AES中的激发光源 过程：30kV 脉冲电压-火花-局部高热-样品元素蒸发-原子或离子-经加速进入质量分析器进行分离 特点：对于几乎所有元素的灵敏度较高，可达10-9；可以对极复杂样品进行元素分析，信息比较简单，一般线性响应范围都比较宽，标准核准比较容易。但由于仪器设备价格高昂，操作复杂，限制了使用范围,2023年2月28日星期二,108,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,快原子轰击(FAB)过程：高速电子惰性气体电离Ar+电场加速高能Ar+电荷交换室高能Ar原子撞击涂有样品的金属板能量转移给样品分子电离引入质量分析器,2023年2月28日星期二,109,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,底物：实验时通常预先将试样和底物调和并涂在金属靶（常用铜靶）上。常用的底物有甘油、硫代甘油、三乙醇胺等，性能良好的底物应是相对分子质量小、沸点高、对试样的质谱干扰小等,2023年2月28日星期二,110,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,FAB特点：无需气化，整个过程可在室温下进行，有较强的分子离子峰，适合于高极性，大相对分子质量，低蒸气压，热稳定性差的试样，试样用量少并可回收,2023年2月28日星期二,111,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,电喷雾电离源（ESI)电喷雾电离源主要应用于LC-MS联用，它是LC和MS之间的接口装置，又是电离源 原理：主要部件是两层套管组成的电喷雾喷嘴，内层是LC流出物，外层是雾化气（常用氮气），喷嘴上加电压，在雾化的同时，样品电离，形成带有高电荷微粒的雾，再使用N2气帘阻挡中性的溶剂分子，只让样品离子在电压梯度下进入质量分析器,2023年2月28日星期二,112,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特点：适用于强极性，大分子量的样品分析如肽，蛋白质，糖等；产生的离子带有多电荷；主要用于液相色谱质谱联用仪,2023年2月28日星期二,113,2023年2月28日星期二,114,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,大气压化学电离源（APCI)原理：结构和电喷雾电离源相似，不同在于喷嘴下放一针状放电电极，通过它的高压放电，使空气中某些分子产生H3O+,N2+,O2+,O+离子，这些离子再和分析物分子发生分子离子反应使它们离子化，形成质子转移，加成物等准分子离子,2023年2月28日星期二,115,特点：APCI主要产生的是单电荷离子，所分析的化合物的相对分子量通常小于1000,2023年2月28日星期二,116,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,激光解吸源（LD)原理：利用一定波长的脉冲激光照射样品，使样品电离。被分析物质放在涂有基质的靶上，激光于极短时间照射，基质吸收能量并且把能量传给被分析物质，和它们一起蒸发到气相并使样品分子电离,2023年2月28日星期二,117,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特点：也称为基质辅助激光解吸电离源（MALDI），属于软电离技术，特别适宜飞行时间质谱仪（TOF），激光电离源必须有合适基质才能有好的离子产率，常用基质有2，5二羟基苯甲酸，芥子酸，烟酸等，适宜分析生物大分子,2023年2月28日星期二,118,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,质量分析器作用：将不同离子碎片按质荷比 m/z 分开，将相同m/z的离子聚集在一起，组成质谱 质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获等,2023年2月28日星期二,119,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,磁分析器原理：主要部分是一对电磁铁(常用扇形),当离子源中产生的离子束(通常是正离子束)经加速电场加速后,以一定的速度进入垂直于离子运动方向的均匀磁场时,正离子在磁场施加的向心力的作用下,改变运动方向(磁场不改变离子的运动速度)作圆周运动，运动轨道半径与运动速度、磁场强度、离子的质荷比有关,2023年2月28日星期二,120,2023年2月28日星期二,121,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,设离子的电荷为z,质量为m,加速电场的电压为U,进入磁场时的运动速度为v,则,如果磁场强度为H,运动轨道半径为R,则由于离子作圆周运动的离心力等于磁场力，因此：,2023年2月28日星期二,122,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,合并上述两式，可得：,磁分析器质谱方程式,通过连续改变H、R、U这三个参数中的任一个并保持其余两个不变的方法,就可以使不同质荷比的离子顺序到达检测器产生信号而获得质谱图,2023年2月28日星期二,123,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,(a)固定H和U，改变R，即通过移动检测器狭缝位置来收集不同R处的离子或以感光板照相技术记录的不同m/z的离子得到色谱图(b)现代质谱仪通常是保持R不变，通过扫描电场U或磁场H，使不同m/z离子依次通过固定狭缝来获得质谱图,2023年2月28日星期二,124,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,单聚焦质量分析器原理：以一定发散角度和能量/速度的离子，进入质量分析器后，一方面会使离子束按质荷比的大小分离（顺序到达检测器）；另一方面能量/速度相同的，角度不同的相同质荷比离子，以相同的半径（R=mv/zH）到达检测器即重新会聚起来，成为方向聚焦；能量/速度不同的相同质荷比离子则以不同的半径到达检测器，无法聚焦,2023年2月28日星期二,125,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特点：聚焦方向，无法聚焦能量，故其分辨率较低，一般为5000,2023年2月28日星期二,126,能量相同，方向不同的离子半径相同,能量不同，方向不同的离子半径不同,2023年2月28日星期二,127,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,双聚焦质量分析器原理：为克服动能或速度“分散”的问题，即实现所谓的“速度聚焦”，在离子源和磁分析器之间加一静电分析器，质量相同能量不同的离子通过电场后会产生能量色散（不同能量以不同半径运动），磁场对不同能量的离子也能产生能量色散，如果能使电场和磁场对于能量产生的色散相互补偿（大小相等，方向相反），就能实现能量聚焦,2023年2月28日星期二,128,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,磁场对离子的作用具有可逆性：由某一方向进入磁场的质量相同的离子，进入磁场后，会以一定能量顺序分开；反之，从相反方向进入磁场的以一定能量顺序排列的质量相同的离子，经过磁场后会聚集在一起,2023年2月28日星期二,129,2023年2月28日星期二,130,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特点：一般商品化双聚焦质谱仪的分辨率可达150000，质量测定准确度可达0.03gg-1，即对于相对分子质量为600的化合物可测至误差上0.0002u,2023年2月28日星期二,131,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,飞行时间分析器这种分析器的离子分离是非磁方式达到的，因为从离子源飞出的离子动能基本一致，在飞出离子源后进入一长约1m的无场漂移管，在离子加速后的速度为：,2023年2月28日星期二,132,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,此离子达到无场漂移管另一端的时间为：t=L/故对于具有不同m/z的离子，到达终点的时间不一样：由此可见，t 取决于m/z的平方根之差,2023年2月28日星期二,133,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,因为连续电离和加速将导致检测器的连续输出而无法获得有用信息（因为按时间分离），所以TOF是以大约10KHz的频率进行电子脉冲轰击法产生正离子，随即用一具有相同频率的脉冲加速电场加速，被加速的粒子按不同的（m/z）1/2的时间经漂移管到达收集极上，并馈入一个水平扫描与电场脉冲频率一致的示波器上，从而得到质谱图,2023年2月28日星期二,134,2023年2月28日星期二,135,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,特点：A)仪器结构简单,操作容易,不需要磁场、电场等 B)无聚焦狭缝，灵敏度很高 C)可用于大分子的分析（几十万原子量单位）D)扫描速度快(1000幅/s)，可用于研究快速反应或与GC联用 E)分辨率比磁分析器稍差，受飞行距离的限制,2023年2月28日星期二,136,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,四极滤质器过程：又称为四极杆质量分析器，由四根截面为双曲面或圆形的平行杆组成，对角的电极为一组，用导线相联，电位相等，两组电极间加上一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压,2023年2月28日星期二,137,2023年2月28日星期二,138,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,当高速运动的离子束穿过准直小孔进入四极杆之间的空间时，在高频电场的作用下发生振荡，在一定的电压和频率下，只有一种质荷比的离子会形成稳定的振荡通过四极杆到达检测器，其余离子则因振幅不断增大，撞在电极上而被过滤掉,2023年2月28日星期二,139,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,如果使交流电压的频率不变，连续的改变直流和交流电压的大小（保持他们的比例不变）（电压扫描）或保持电压不变连续的改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达检测器特点：分辨率比磁分析器略低(max.2000);m/z范围与磁分析器相当；传输效率较高；扫描速度快，可用于GC-MS 联用仪,2023年2月28日星期二,140,第二节 蛋白质组学研究的技术体系,离子阱过程：上下端罩电极