第4章花粉培养和单倍体育种.ppt

花药培养和单倍体育种,1,第四章 花药培养和单倍体育种,花药培养是单倍体育种的一种重要方法。实际上，单倍体育种是在花药培养技术建立起来以后才得以迅速发展成为一种高效的育种手法。在这一章中，我们先复习一下有关的植物学知识，在这个基础上学习花药培养的操作技术，然后再了解花药培养在育种工作上有哪些方面可以应用，最终达到能够利用花药培养的方法进行作物育种或解决遗传研究中的理论问题。,花药培养和单倍体育种,2,第一节 相关知识基础一、植物的有性生殖习性和杂交育种,自然界的植物通常是二倍体或偶数多倍体，体细胞染色体的一半来自父本，另一半来自母本。在自花受粉植物中，开花受精过程在同一朵花中进行，没有父母本之分。经过多代的自交，形成了基因型纯合的植物体，例如水稻和大多数的豆科植物。利用基因型纯合的植物种子进行栽种得到的植物群体不会产生性状的分离。,花药培养和单倍体育种,3,第一节 相关知识基础一、植物的有性生殖习性和杂交育种,在异花受粉植物中，由于父本和母本提供的染色体基因组有所不同，因此，后代个体中必然有一部分基因是杂合的。由这些杂合基因控制的性状在子代中将产生分离。有性杂交育种就是利用不同品种亲本的杂交产生基因型杂合的种子，栽培这些种子，通过多代自交使基因型从杂合逐渐趋向纯合稳定，然后从中选择出有别于原来父母本的优秀变异个体从而达到培育优良品种的目标。,花药培养和单倍体育种,4,第一节 相关知识基础二、单倍体植物及其特点,单倍体是指体细胞的染色体数目只有二倍体细胞的一半的情况。在植物的正常发育过程中，只有减数分裂后形成的大、小孢子和由这些孢子形成的雌、雄配子体的细胞是单倍体。由单倍体细胞发育而成的植株也就是单倍体植物。单倍体植株常常在形态和生理状态上和二倍体植物有明显的差别，例如植株比较矮小，叶片较薄，生活力弱，抗逆性差，而且高度不孕。,花药培养和单倍体育种,5,第一节 相关知识基础二、单倍体植物及其特点,单倍体植物在自然界中竞争力很差，又不能靠有性过程延续后代，因此，自然存在的单倍体植株很少，特定个体的存在时间也很短，难以被发现和利用。单倍体植物由于只有一个染色体组，因此单倍体植株的另一个特点是基因没有显隐性关系。由于单倍体的这种特性，可以利用单倍体对有用的隐性基因突变体进行选择，并可将单倍体植株的染色体加倍得到遗传稳定的纯合二倍体。因此，单倍体是遗传学研究和作物育种的重要材料。,花药培养和单倍体育种,6,第一节 相关知识基础三、花药培养的简史和概况,第一个被发现的单倍体植物是1921年Bergner在蔓陀罗植物群体中发现的。发现单倍体植物后不久，1924 Blakeslee和Belling就提出了在植物育种中利用单倍体减少杂交后代分离，加速性状稳定，缩短育种年限的设想。由于自然条件下出现的单倍体很少，此后育种学家和植物学家的工作主要集中在对单倍体植株的人为诱导方面。由于当时组织培养技术的水平还很低，直到 1964年才由Guha和Maheshwari利用花药培养的方法在毛叶蔓陀罗这个植物种上取得成功。,花药培养和单倍体育种,7,第一节 相关知识基础三、花药培养的简史和概况,单倍体在育种上的重要价值极大地刺激了人工培养花药和花粉诱导单倍体的研究。前几年的统计数字显示能够诱导形成单倍体植株的植物种已经达到34科88属的247种植物。我国的科学工作者在这方面也作出了重要的贡献，例如，小麦、玉米、甘蔗、橡胶、杨树、荔枝、龙眼、亚麻和甜菜等植物的单倍体植株都是我国的科学工作者首次通过花药培养取得的。,花药培养和单倍体育种,8,第一节 相关知识基础四、花粉的发育过程,在被子植物中，常用花粉粒这一名称代表雄配子体，而由小孢子母细胞经减数分裂形成的小孢子是雄配子体的第一个细胞。减数分裂刚结束时形成的4个小孢子以四分体的形式存在，即共处在一胼祗质组成的壁内。不久，胼胝质壁溶解，4个小孢子即彼此分开。,花药培养和单倍体育种,9,第一节 相关知识基础四、花粉的发育过程,由小孢子发育至成熟的花粉需要经过2次分裂，第一次分裂形成一个大的营养细胞和一个小的生殖细胞；第二次分裂只发生在生殖细胞，形成2个雄配子即精子。在花粉发育过程中有2个明显的细胞学变化，一是在小孢子第一次分裂前形成一个大的中央液泡，把小孢子核推向花粉的一边；另一个变化是随花粉的成熟在花粉中积累大量储藏物质。在花粉管伸长过程中，营养细胞逐渐退化。,花药培养和单倍体育种,10,第一节 相关知识基础四、花粉的发育过程,减数分裂 有丝分裂 胼胝质壁溶解小孢子母细胞 2个小孢子 4个小孢子 单个小孢子 形成大液泡，分裂 积累储藏物质单个小孢子 营养细胞在花粉管伸长过程中退化+分裂 生殖细胞 2个精子（双受精）,花药培养和单倍体育种,11,第二节 花药培养技术一、供体植株的准备,1.自花受粉植物 由于是基因型纯合的植物，仅能产生一种基因型的配子体，配子体发育成为单倍体后，如果进行加倍，只能回到和出发材料相同的二倍体基因型，没有实际价值。因此，自花授粉植物必须首先进行杂交，取得杂种一代并进行栽种，以杂种一代的花药进行培养才能得到各种基因型的植株，供育种选择。2.异花授粉植物 由于是杂合基因型，因此，能够产生多种不同基因型的花粉，培养这些花粉可以得到各种基因型的植株，供育种选择。当然，根据育种目标选择父本进行杂交也常常是必要的。,花药培养和单倍体育种,12,第二节 花药培养技术一、供体植株的准备,3.供体植株的栽培条件 栽培条件影响到花药的营养水平和生理状态等。在烟草的花药培养中发现高光强和短日照条件相对有利于花粉胚的形成，大麦则在长日照和具有日夜温差的较低温度条件下有利于愈伤组织的形成。施肥水平也影响花药培养的结果，降低氮肥的施用量可以显著提高花粉愈伤组织的形成率和花粉胚的数量。此外，不育系的花粉往往具有明显较好的愈伤组织形成率，采用化学药剂进行去雄处理也能提高培养效率。,花药培养和单倍体育种,13,第二节 花药培养技术二、选材,1.发育时期 花粉发育时期的不同会影响到花粉胚或花粉愈伤组织的形成率的高低，对花药培养取得单倍体植株关系重大。对大多数植物种来说，最合适的培养时期是花粉第一次有丝分裂（形成营养和生殖两个细胞）的前后或期间，但不同的植物种在培养中所表现的最适时期也可能有差异。,花药培养和单倍体育种,14,第二节 花药培养技术二、选材,花粉发育时期的确定一般采用对花药进行染色压片后在显微镜下观察的方法。染色的染料一般是醋酸洋红，也叫醋酸卡红（acetocarmine）。通过染色可以简单地辨别减数分裂前期的花粉母细胞，减数分裂后的四分体初期和后期，单核期和双核期等。在染色镜检后，通过建立花粉适当时期和植株某些器官的发育阶段特征的联系就可以进行准确有效的选材。例如，水稻采样的合适时期是剑叶完全抽出后剑叶叶片基部距离前一片叶的叶片基部2-10厘米左右时；矮牵牛是花瓣开始显色的时候。,花药培养和单倍体育种,15,第二节 花药培养技术二、选材,2.发育时期与花粉二型性 在同一个花药里，花粉的发育并不完全同步。在花粉囊中的花粉群体中常有一部分花粉的发育落后于其他正常的花粉，当正常的花粉成熟时，这些发育落后的花粉可能正在进行第一次分裂。这种在花药中存在着发育阶段不相同的花粉的现象就叫做花粉的二型性。花粉二型性使得花药培养取材时在花药的成熟度上可以有一定的差别幅度。,花药培养和单倍体育种,16,第二节 花药培养技术二、选材,有研究结果表明，发育落后的花粉在培养条件下有发育成愈伤组织或胚的更大可能，并将这部分花粉称为胚性花粉。在大麦中，花药下半部的异常花粉的比例比花药上半部的比例高，因此，由花药下半部的花粉形成的愈伤组织也比上半部要多。异常花粉并不是愈伤组织的唯一起源，正常的花粉也是可以形成愈伤组织或胚的，不过两者在对培养基的反应程度有不同。,花药培养和单倍体育种,17,第二节 花药培养技术二、选材,3.基因型 植物种相同但品种不同的花药，采用相同的培养方法有时也会得到差异很大的结果，这种差异是由植物的基因型的不同造成的。基因型的不同导致培养结果的差异是一种普遍现象。综合很多实验结果发现在水稻各亚种和品种中存在着明显的差异，培养效率随下列顺序下降：粳型糯稻、粳稻、籼粳杂种、粳籼杂种、籼型杂交稻、籼稻。在大麦中也表现出一些规律性，即2棱大麦比4棱和6棱大麦的培养效率要好。,花药培养和单倍体育种,18,第二节 花药培养技术三、花药培养前的预处理,1.低温处理 低温处理能够改善花药培养效果是1973年在培养烟草和毛叶蔓陀罗的实验中发现的。后来证明低温处理对很多植物种的花药培养都有促进作用，不过，各种植物的最合适的处理温度和处理时间长度有不同。方法：一般的处理方法为4-10度的低温和1到2个星期的处理时间。低温处理时的植物材料状态也对处理效果有显著影响，以大麦为例，剥去包住大麦幼穗的叶梢和切除麦穗上的芒然后才进行低温处理能够提高培养效果。,花药培养和单倍体育种,19,第二节 花药培养技术三、花药培养前的预处理,原理：有低温刺激和低温逆境反应两种解释。低温刺激认为低温促使单核期花粉的第一次有丝分裂由不均等分裂转为均等分裂，而低温逆境则认为低温增强了营养细胞的分裂，使生殖细胞退化。一般认为预处理使花粉的发育容易偏离正常的配子体发育方向，并在培养条件的刺激下分裂形成单倍体的体细胞。经过去雄处理的水稻花药以及雄性不育系的花药比正常花药的培养反应要好的事实说明不能正常发育的花粉更适合进行培养。,花药培养和单倍体育种,20,第二节 花药培养技术三、花药培养前的预处理,2.其他预处理方法 1）离心处理法 对烟草、水稻、玉米和小麦有一定效果，一般是在2000转/分，处理30分钟。2）喷洒乙烯利的方法 小麦在减数分裂前，水稻在孕穗前用浓度在0.2-0.4%之间的乙烯利喷洒。这种乙烯利处理法最初是用来进行杂交前母本去雄。3）高渗透负压处理法 用25%的蔗糖溶液或渗透压相同的甘露醇或无机盐溶液短时间，6-8分钟，处理花药。,花药培养和单倍体育种,21,第二节 花药培养技术三、花药培养前的预处理,2.其他预处理方法4）大气压力 有时会对培养结果产生明显影响。例如进行10-60分钟的短期降压处理可以提高烟草花药形成愈伤组织的百分率和每个花药形成植株的数量，但如果减压时间延长至24小时以上则会抑制花粉植株的形成。5）气体成分含量也会对培养结果产生影响，例如采用100%的氮气对烟草花药进行处理30分钟以上可以促进花粉胚和植株的形成。,花药培养和单倍体育种,22,第二节 花药培养技术四、培养基的确定,1.培养基基本成分 大多数植物的花药培养可以用MS培养基或按比例降低大量无机成分的MS培养基来进行培养，N6培养基则最适合水稻等禾本科植物种的花药培养。2.生长调节剂 有些植物种的花药培养对培养基中的激素种类和水平要求并不高。例如，烟草和曼佗罗的花药在仅含有蔗糖和无机盐的培养基上就能形成花粉胚和发育成完整的植株，整个过程不需要添加外源激素进行调节。但外源激素对大多数植物的花药培养仍然是必不可缺的。,花药培养和单倍体育种,23,第二节 花药培养技术四、培养基的确定,3.蔗糖 蔗糖在花药培养中具有双重的作用。第一是作为碳源，第二是作为渗透压调节剂。不同的植物其花药培养的最合适的糖浓度有不同。禾本科不同植物的花药培养对蔗糖浓度的要求存在显著差异：稻为6%左右，小麦和大麦为6-9%,，玉米为12-15%，而甘蔗则高达20%。高浓度的蔗糖浓度一般只在培养初期的愈伤组织诱导阶段需要。诱导体细胞胚的形成常常需要把蔗糖浓度降低，而要促进植株再生，就必须把蔗糖浓度降低到3%左右才能取得好的培养效果。,花药培养和单倍体育种,24,第二节 花药培养技术四、培养基的确定,4.其他营养成分 花药培养中有明显作用的是氨基酸，包括脯氨酸、羟脯氨酸、天冬酰氨、谷氨酸和谷氨酰氨等。在小黑麦的花药培养中以脯氨酸的作用效果最为明显，有实验发现脯氨酸的添加可以使愈伤组织的形成率增加6倍。而羟脯氨酸的添加还能显著增强愈伤组织的植株再生能力。,花药培养和单倍体育种,25,第二节 花药培养技术四、培养基的确定,在大麦、玉米和水稻花药培养中，脯氨酸的促进作用也是十分明显的。烟草的花药培养比较容易成功，在烟草花药培养中脯氨酸，谷氨酰氨、天冬氨酸、天冬酰氨、谷氨酸和丙氨酸都能不同程度地促进花粉的胚胎形成。其他成分的作用报道不多，在大麦的花药培养中发现肌醇能促进花粉愈伤组织的形成。,花药培养和单倍体育种,26,第二节 花药培养技术五、培养条件的确定,1、液体悬浮培养和固体培养基培养固体培养基的应用最多，采用质量好的琼脂一般都能取得比较好的培养效果。在有必要的情况下可以考虑采用琼脂糖。液体培养基在花药和花粉培养中也常有应用。液体培养基不使用琼脂，可以避免琼脂中的杂质的有害作用。在液体的情况下形成的愈伤组织将分散到培养基中，因此不能计算愈伤组织的形成率。,花药培养和单倍体育种,27,第二节 花药培养技术五、培养条件的确定,2.温度 芸苔属植物的花药在开始培养到培养基上以后的最初几天进行高温处理，也就是培养在35摄氏度条件下，然后再培养到25摄氏度的正常温度条件下也可以显著提高花粉胚的形成。对于高温短期培养的反应在不同植物种和种内不同品种之间存在着差异。对于具体的植物材料需要进行实验比较才能得到可靠的结论。在水稻和小麦的花药培养中，如果长期培养在高温条件下，将会使白化苗的比例升高。,花药培养和单倍体育种,28,第二节 花药培养技术五、培养条件的确定,3.花药在培养基上的培养放置方式 比较大型的花药以纵轴和培养基平面平行的方式培养的效果较好；小型的花药难以进行准确的培养方式的操作，一般是任其自然地撒落在培养基表面。4.培养密度 培养密度对培养结果有影响，在液体培养和花药小的情况下的影响更加明显。理想的密度和植物品种和花药大小有关。,花药培养和单倍体育种,29,花药培养和单倍体育种,30,不需要高密度有如下优越性,减少污染可以采用大的培养瓶和较多的培养基可以培养较长时间，减少继代操作次数,花药培养和单倍体育种,31,第二节 花药培养技术六.花药体细胞组织对培养结果的影响,花药壁体细胞组织能够分泌出一些对花药或花粉培养有促进作用的物质。最直接的证明是花粉培养，将花粉从新鲜的花药中分离出来直接进行培养比较困难，但如果先不要分离花粉而是培养花药，一段时间后再将花粉从花药中分离出来进行培养就比较容易成功。利用短期培养过花药的培养基上培养花药也可以取得更高的愈伤组织或胚的形成率。,花药培养和单倍体育种,32,第二节 花药培养技术六.花药体细胞组织对培养结果的影响,在培养基中加入花药水提取物也可以提高培养效果。在大麦的花药培养中发现，花药组织的这种有利于花药培养的内含物质的作用和花药的发育程度有关，随着花药的成熟，这种作用也随着增强。进一步的研究表明，这种物质对高温不稳定，在花药培养的整个过程中都有这种物质的生成，并且物种的特异性不明显。,花药培养和单倍体育种,33,第二节 花药培养技术七.培养操作,1、材料的灭菌 材料的灭菌一般都不是直接对花药进行灭菌，而是对含有花药的花蕾或颖花进行灭菌。由于花蕾或者颖花出现的时间比较短，因此比较洁净，并且，因为不是直接灭菌，因此，灭菌时可以采用较强的灭菌液浓度，采用常规的灭菌方法就可以得到较好的灭菌效果。2、培养操作 灭菌后进行培养操作，一般用两把尖嘴镊子，将花朵打开或撕开，把花药夹断后接种到培养基上，注意尽量少带花丝等其他组织，注意将各个花药适当分散开进行培养。,花药培养和单倍体育种,34,第二节 花药培养技术八.花药培养中的问题,1.白化苗(albino)问题 再生植株的茎叶组织细胞中缺乏叶绿体的现象。在由愈伤组织培养再生的植株中经常可以观察到，而在花药培养中这种情况尤为突出，成为花药培养中的一个严重问题。白化苗的出现是由于再生植株的细胞中和叶绿体发育有关的叶绿体基因组的基因的缺陷造成，是遗传基础的问题，因此没有办法让白化苗转绿。有些条件会影响白化苗的出现频率。例如，在花药小孢子第一次有丝分裂前经历了较高温度；花药的发育时期过老等，都会增加白化苗的出现频率。,花药培养和单倍体育种,35,花药培养和单倍体育种,36,第二节 花药培养技术八.花药培养中的问题,2.愈伤组织形成率低的问题 多数植物中存在的问题。例如粳稻中大部分品种在目前的培养技术条件下的愈伤组织形成率不足5%，籼稻的大部分品种仅为0.5%或以下。由于愈伤组织形成率低，所以，尽管在减数分裂遗传重组的过程中形成了很多种基因型的花粉，但也只有少数基因型的花粉能够发育成为单倍体植株。由于愈伤组织形成率低，通过花药培养后产生的可供选择的群体往往不是很大，再加上培养基的选择作用，因此，减少了群体基因型的丰富程度，严重降低了从中选择优良品种的可能性。,花药培养和单倍体育种,37,第三节 花粉植株,花粉细胞发育而成的植株称为花粉植株；在花药培养中，只有由花药中的花粉细胞发育而成的植株才在育种上有应用价值。,花药培养和单倍体育种,38,第三节 花粉植株一、花粉植株的形成,1.初期细胞学的发育过程在花药培养中，花粉偏离正常的配子体发育途径而转向孢子体发育途径。在这个过程中根据植物种和花粉发育时期的不同，小孢子分裂有如下方式：1）不均等（形成营养细胞和生殖细胞）：a.营养细胞发育 b.生殖细胞发育 c.两种细胞融合，二倍体、多倍体 d.分别分裂，嵌合花粉多细胞结构2）均等:(形成二个相同单倍体细胞):多种可能的发育模式,花药培养和单倍体育种,39,第三节 花粉植株一、花粉植株的形成,2，组织培养再分化过程 取得单倍体植株是育种的必要环节，花粉植株的形成有直接形成和间接形成两种方式。直接形成是花粉经有限次的分裂后形成不定胚的情况，间接形成是花粉经过较多次的分裂形成愈伤组织，在愈伤组织的基础上再分化形成植株的情况。,花药培养和单倍体育种,40,第三节 花粉植株一、花粉植株的形成,2，组织培养再分化过程 有些植物种的花药培养对培养基的要求不高，例如烟草和曼佗罗的花药能够在没有激素的培养基上形成花粉胚，同时这种胚能够在原来的培养基上继续发育直接发芽生根成为完整的植株。大多数植物种的花药在培养过程的不同阶段需要不同的激素条件，例如有些在形成愈伤组织需要生长素，而在组织再分化再生植株的时候需要分裂素，又有些在形成花粉胚的时候需要生长素，而在花粉胚发芽生根的阶段则需要降低生长素的浓度或完全不需要外源激素。,花药培养和单倍体育种,41,第三节 花粉植株二、花粉植株的遗传特性,花粉愈伤组织和再生植株的染色体倍数性常常有很大的变化范围，不仅有单倍体，也有二倍体和多倍体。由花粉直接形成胚后长成的植株可以减少倍数性的变化，但出现各种倍数的细胞和植株仍然是难以避免的。此外，不同分类种属的植物的花粉植株在倍数上的表现也各有特点。,花药培养和单倍体育种,42,第三节 花粉植株二、花粉植株的遗传特性,花粉愈伤组织细胞中倍数性的变化更加常见，单倍体细胞的比例随着培养时间的延长或继代次数的增加而不断减少，二倍体，多倍体和非整倍体的细胞数目增加。这种情况必然也会影响到再生植株的倍性。在水稻花药培养再生植株中，常常可以观察到多种倍性的再生植株，而以二倍体植株为主，这对应用花药培养技术在短期内获得纯合二倍体植物很是有利。小麦的情况和水稻相似，但单倍体植株的比例明显更高。,花药培养和单倍体育种,43,第三节 花粉植株三、单倍体植株的鉴定,1，形态学的鉴定 由于培养容器内的特殊环境对再生植株形态表现的严重影响，培养容器内的植株难以进行形态学方面的鉴定，只能在栽培条件下才能进行。在栽培条件下，由于再生植株先天性的极大差异，形态学鉴定往往也难以得到可靠的结论。我们最近的工作：,花药培养和单倍体育种,44,花药培养和单倍体育种,45,花药培养和单倍体育种,46,第三节 花粉植株三、单倍体植株的鉴定,1，形态学的鉴定 由于培养容器内的特殊环境对再生植株形态表现的严重影响，培养容器内的植株难以进行形态学方面的鉴定，只能在栽培条件下才能进行。在栽培条件下，由于再生植株先天性的极大差异，形态学鉴定往往也难以得到可靠的结论。2，细胞学鉴定 细胞学鉴定能够提供可靠的结论，往往采用根尖细胞进行染色压片后在显微镜下对处在分裂期内的细胞染色体数目进行观察。,花药培养和单倍体育种,47,花药培养和单倍体育种,48,第三节 花粉植株四、单倍体植株的染色体加倍,有些植物花药中的花粉，在培养过程中分裂增殖形成的单倍体细胞容易进行自发加倍，由此再生的植株就是二倍体，不需要特别的染色体加倍措施。多数植物在花药培养中，单倍体细胞或组织的自然加倍的频率很低，得到的植株绝大多数是单倍体植株。由于单倍体植株不能正常结实，在农业生产上也不能直接应用，因此，除了利用无性繁殖的方式保持单倍体植株进行遗传学的研究之外，有必要对单倍体材料进行染色体加倍的处理。,花药培养和单倍体育种,49,第三节 花粉植株四、单倍体植株的染色体加倍,对单倍体材料进行加倍处理有多种形式：对于培养瓶中的再生小苗，可以用0.2-0.4%的秋水仙素浸泡24-48小时；对于移栽后的植株，可以用秋水仙素溶液处理茎尖。此外，利用单倍体植株的组织进行培养诱导愈伤组织的形成，这些愈伤组织中二倍体的比例有可能比较高，诱导这些细胞再生植株可以得到二倍体。,花药培养和单倍体育种,50,第四节 花粉培养一、概况和特点,1，概况 花粉(pollen)培养的研究工作开始于50年代，虽然花粉培养的开展没有花药培养那么普遍和广泛，但经过40多年来的发展，现在花粉培养的方法也已经比较完善。花粉培养也叫离体的小孢子培养。在单倍体育种中和花药培养具有相同得作用，但花粉培养有时比花药培养更具有优越性。花粉是单纯的单倍体细胞，由花粉培养形成的愈伤组织或再生植株都是单倍体或者是通过染色体自然加倍的纯合体。,花药培养和单倍体育种,51,第四节 花粉培养一、概况和特点,2，特点 花药培养是以花药的形式培养花粉，只有由花粉形成的植株在育种上才有意义。由于花药培养除了培养花粉外，还有花丝和花隔等二倍体组织。因此，由花药培养得到的愈伤组织存在着由二倍体组织起源的可能性。有些植物的花药二倍体组织形成愈伤组织的能力比较强，在这种情况下通过培养花药得到单倍体细胞组织和单倍体植株就很困难。花粉培养虽然难度较大，但可以排除花药二倍体组织的影响，对某些植物种具有更实用的意义。,花药培养和单倍体育种,52,第四节 花粉培养二、花粉的分离,1、机械分离法 不同的植物分离方法可以有些不同。以烟草为例，将合适时期的花蕾取下进行5度低温处理48小时，对花蕾进行表面灭菌后取出花药，将花药放进少量的液体培养基中培养4天后用玻璃棒等挤压花药，释放出花粉粒，然后将所有材料过筛，一般是采用48微米的孔径。过筛后的花粉悬浮液进行离心沉淀，3-5分钟800-1000转/分，为了得到纯度高的花粉，可以加入相同的液体培养基后再离心一次。,花药培养和单倍体育种,53,第四节 花粉培养二、花粉的分离,2.培养花药散落花粉法 利用花药在培养过程中自然开裂将花粉散落在培养基里。这种方法的关键是要找出一种能够使花药在培养过程中自然开裂的培养处理条件。大麦是利用这种方法取得成功的一种植物。取单核花粉期的大麦幼穗在摄氏7度低温条件下处理14天后进行液体培养可使花药开裂散出花粉；在液体培养基中添加肌醇和谷氨酰胺可以增加花粉的散出量。,花药培养和单倍体育种,54,第四节 花粉培养三、花粉的培养,花粉培养比花药培养在操作上要繁杂一些，在很多情况下要得到花粉愈伤组织或再生植株也相对困难。一般是在有必要排除花药二倍体组织的影响的情况下才采用。花粉培养一般是先进行浅液体层静止培养的方法，也可以采用液体悬浮培养。培养时首先要调整好花粉的密度，一般情况下是采用血球计数板在显微镜下进行，密度为每毫升1万个花粉左右。花粉的液体培养不仅在烟草上取得成功，水稻，大麦，小麦，茄子等也都有成功的报道。,花药培养和单倍体育种,55,第四节 花粉培养三、花粉的培养,当花粉形成1-2毫米大直径的细胞团后，一般是转移到固体培养基上继续增殖或诱导植株再生。和花药培养相似，在花粉培养中，MS是常用的培养基之一，而且花粉培养也往往需要使用较高的渗透压，一般是采用高浓度的蔗糖或加入适量的甘露醇。,花药培养和单倍体育种,56,第五节 诱导形成单倍体的其他途径一、未授粉的子房和胚珠的培养,1、原理和概况 花药和花粉是雄性组织和细胞，植株上的雌性组织和细胞也可以作为诱导单倍体的材料。植株上的雌性组织是子房和胚珠，胚珠在子房内，胚珠中有胚囊，胚囊在授粉前含有单倍体的细胞。子房和胚珠的培养目的就是要促进胚囊中的单倍体细胞发育成为单倍体植株。由未授粉的子房或胚珠培养诱导单倍体形成在1976年在大麦首次获得成功，这是一种雌核发育的方式。现在，在烟草，水稻，玉米，向日葵，杨树等的未授粉子房的培养也都得到了单倍体。,花药培养和单倍体育种,57,第五节 诱导形成单倍体的其他途径一、未授粉的子房和胚珠的培养,2，胚囊和雌配子体的发育过程 由大孢子母细胞减数分裂形成四分体，再继续发育成胚囊。在大孢子发育成为胚囊的过程中，首先发生细胞体积增大，同时出现液泡，接着发生连续3次核的分裂，形成8核胚囊。在合点端有3个核组成细胞，即反足细胞；而在珠孔端也有3个核组成细胞，即1个卵细胞和2个助细胞。珠孔和合点端各有1个核移到胚囊中央，组成具有2个极核的中央细胞。两个极核也可以融合为二倍体的核，称为次生核。,花药培养和单倍体育种,58,第五节 诱导形成单倍体的其他途径一、未授粉的子房和胚珠的培养,3，培养技术 在培养技术方面缺少系统性的文献，但培养方法理所当然地包括取材，灭菌，培养基，再生植株的染色体倍数性鉴定等方面。在取材方面，首先要保证子房没有受精，因此，可能有必要进行去雄和套袋。第二是要考虑材料的发育时期，发育时期对培养效果影响很大，一般认为发育比较成熟的胚囊的培养比较容易成功，但不同植物的标准不同。其次是考虑材料的基因型，如果有多种基因型可以进行选择时，可以对多个基因型同时进行实验比较，培养能否成功往往与供体植物的基因型有着密切的关系。,花药培养和单倍体育种,59,第五节 诱导形成单倍体的其他途径一、未授粉的子房和胚珠的培养,4.和花药培养的比较 子房培养得到的单倍体一般都是具有生长能力的绿苗，单倍体加倍和多倍体的出现很少。在难以得到绿苗的植物或品种的单倍体育种上可以考虑子房培养。一株植物上子房和胚囊的数目比花粉要少得多，因此培养诱导子房产生单倍体只有在花药培养难以行得通的情况下进行才有实际意义，在单倍体育种上可以认为是花药培养的一种补充或辅助方式。,花药培养和单倍体育种,60,第五节 诱导形成单倍体的其他途径二、远缘杂交消除单方染色体,1、原理和概况 这一方法的原理是两个亲缘关系比较远的物种进行杂交后，杂交亲本的一方染色体在胚胎发育过程中受到排斥而逐渐消失，最终导致单倍体的形成。这种形成单倍体的方式最初是在球茎大麦和普通大麦之间进行杂交中观察到的，因此叫球茎大麦法。球茎大麦除了和普通大麦杂交后会导致染色体消失外，和普通小麦杂交其染色体也会在杂种胚中消失，因此，普通小麦和球茎大麦杂交也可以得到单倍体小麦。,花药培养和单倍体育种,61,第五节 诱导形成单倍体的其他途径二、远缘杂交消除单方染色体,2、方法 利用球茎大麦产生单倍体的方法是以球茎大麦的花粉进行授粉，产生杂种胚，然后培养杂种胚就可以得到大麦或小麦的单倍体植株。单倍体植株经过人工加倍处理就可以得到纯合的二倍体。幼胚的培养一般是采用授粉后2个星期的幼胚进行培养，有报道认为幼胚培养最初以液体培养比较容易成功，待幼胚进一步成熟后才转移到琼脂培养基上培养。,花药培养和单倍体育种,62,第五节 诱导形成单倍体的其他途径二、远缘杂交消除单方染色体,染色体加倍可以在培养瓶中进行，也可以待移栽后，小苗处于3-5叶期进行。处理时，采用每升10毫克赤霉素，2%DMSO，0.3毫升吐温和0.1%秋水仙素在22摄氏度的温度情况下处理5小时,可以取得很好的效果。3、特点 球茎大麦法的优点是基本上不会出现白化苗的问题，并且因为是胚培养，因此不存在诱导植株再生的困难。球茎大麦法的缺点是亲缘关系的远近要合适，要能够进行杂交受精并随后发生单边染色体脱落，因此，在应用上存在着严格的种群局限性。,花药培养和单倍体育种,63,第五节、诱导形成单倍体的其他途径三、延迟授粉法和辐射花粉法（简介）,延迟受粉法是在开花后隔一段时间后才对子房柱头进行授粉的方法，由于受粉时间的延误，因此花粉管没有能够顺利伸长并进入胚囊中完成受精，但这个方法可以产生一种类似受精的作用，刺激胚囊中的单倍体细胞的发育，达到孤雌生殖，形成单倍体种胚的目的。辐射花粉法是利用射线的杀伤力对花粉活力造成一定的损伤，损伤的活力低下的花粉不能完成受精作用但有可能起到刺激孤雌生殖的目的，原理和延迟受粉的方法基本一致。,花药培养和单倍体育种,64,第六节 单倍体的应用一、培育新品种,培育新品种是单倍体最主要的应用。利用单倍体培育新品种具有几方面的优越性：1、缩短育种所需年限 在常规杂交育种中，由于杂种后代各种性状的不断分离，要育成一个遗传稳定的新品种一般需要8-10年的时间。应用单倍体育种，无论是花药或未授粉子房的培养得到的单倍体，经过自然或人工的染色体加倍就可以得到纯合的二倍体，因此可以大大地缩短育种所需年限，也由此可以大大减少田间试验所需的土地和节省劳力。,花药培养和单倍体育种,65,第六节 单倍体的应用一、培育新品种,2、提高选择效率 常规杂交后代会出现基因的分离和重组，除了产生一部分纯合基因型的个体之外，更多的是产生出杂合基因型的个体，这给后代的选择带来了很大的困难。杂交一代如果进行花药培养，加倍后的后代的基因型都是纯合的，减少了大量的杂合基因型，这样就可以提高优良基因型的选择效率。随着不连锁的杂合等位基因数目的增加，单倍体育种的选择效率也随着提高。,花药培养和单倍体育种,66,第六节 单倍体的应用二、作为育种素材,1，利用自然突变或进行人工诱变 由于单倍体的基因没有显隐性关系，因此，无论是在培养过程中引起的体细胞变异或是人工诱变产生的突变体，都可以有效地得到表现和对植株的表现型进行有效的选择。目前，已在烟草和水稻的花药培养单倍体植株中筛选到多种突变体，有些可以直接应用于生产，例如高赖氨酸水稻，有些可以作为遗传研究的重要材料，例如带有特殊遗传标记（氨基酸缺陷型、矮杆等）的植物。,花药培养和单倍体育种,67,第六节 单倍体的应用二、作为育种素材,2，转基因操作（外源基因受体）培养花药产生的单倍体细胞是进行转基因操作的理想材料。导入的基因经过染色体自然加倍或经处理加倍后将成为一对纯合的等位基因，将有可能进行更加稳定的遗传，解决以二倍体细胞作为外源基因受体时常常出现的遗传不稳定的问题。,花药培养和单倍体育种,68,第六节 单倍体的应用三、杂交制种的亲本,两个纯系品种之间的一代杂种具有杂种优势。单倍体经过加倍可以得到基因型纯合的个体，这些个体经过无性繁殖或自花受粉可以得到纯系，因此能够作为父母本进行杂交制种，取得具有优势的种子。异花授粉作物的基因型是杂合的。传统方法要将杂合基因型的异花授粉作物的基因型纯合是进行多次的人工自交。因此，要取得一个基因型纯合的异花授粉作物不仅需要时间和人力，而且要对生长栽培环境进行严格控制，防止外界花粉的传入，操作起来难度很大，技术要求很高。,花药培养和单倍体育种,69,第六节 单倍体的应用 四、特定性别植株的繁殖,有些植物雌雄异株。石刁柏是雌雄异株植物，雄株的生产能力比雌株高，栽培雄株可以取得更高的收益。雌株的基因型是XX，雄株的基因型是XY，正常的有性后代中有一半是雄株，一半是雌株。由雄株花粉培养得到X型和Y型单倍体，加倍后得到XX雌株和YY超雄株。用不同品种的超雄株和雌株杂交制种，不仅可以得到全部都是雄株的F1代，而且可以同时获得杂种优势。优良雌株和超雄株可以通过一般的组织培养无性繁殖方法进行扩繁，作为杂交亲本。,花药培养和单倍体育种,70,第六节 单倍体的应用五、染色体的转移,染色体转移是染色体工程的最主要内容。六倍体小黑麦的染色体组是AABBRR，六倍体小麦的染色体组是AABBDD，两者杂交F1代杂种AABBDR的染色体组中有D和R两组不能配对的单价体，在减数分裂中，这两组单价体，每组有7条单价染色体，将会以07的各种可能出现在子细胞中，形成具有各种染色体组成的花粉粒。培养这些花粉就有可能从中得到各种染色体转移的植株，建立起染色体代换系或染色体附加系。染色体代换系和染色体附加系是进行遗传育种的重要材料。,花药培养和单倍体育种,71,本章小结,随着单倍体诱导培养技术的日趋成熟，单倍体技术正被纳入越来越多的农作物的育种程序之中。单倍体技术的运用不仅极大地缩短了传统方式的育种周期，也为遗传研究提供了重要的材料。单倍体技术是植物生物技术的重要组成部分，和常规遗传育种技术有着密切的联系。只有把单倍体技术和常规遗传育种技术相结合，才能充分发挥单倍体技术的优越特点，在遗传育种的实际工作中取得最大成功。,花药培养和单倍体育种,72,思考题,1.单倍体育种有什么优越性？2.如何取得适合培养的花药材料？3.掌握花药培养单倍体育种的主要过程。4.花药和花粉培养的优缺点比较。5.单倍体技术有哪些方面的主要应用？,