第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产.ppt

第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产,陈观水生命科学学院13905914445,第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产,主要内容：第一节 植物单细胞培养技术 第二节 植物细胞的大规模培养 第三节 植物细胞生物反应器 第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物 学习的目标与要求：掌握单细胞分离和培养的方法，了解植物大规模培养方法，了解植物细胞生物反应器的设计与要求。了解利用植物细胞培养生产次生代谢产物的流程。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一。80%的天然产物来自于高等植物。资源的过度采掘，造成了许多植物资源的日益枯竭。通过植物细胞培养是弥补这方面的重要研究方向,植物细胞培养和次生代谢产物生产,红豆杉惨遭剥皮,植物细胞培养和次生代谢产物生产,细胞产物的工厂化生产,植物细胞培养和次生代谢产物生产,什么是植物细胞培养?与组织培养的区别?植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物组织培养培养对象 植物的各种组织、器官培养目的 获得所需的植物组织和再生植株；快速繁殖。,细胞培养培养对象各种形式的植物细胞培养目的获得所需的细胞和各种所需的产物；进行生物转化；将外源底物转化为所需的产物。,与植物组织培养的区别,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞培养的应用获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术,植物细胞培养和次生代谢产物生产,与微生物相比，植物细胞的特点：细菌、真菌、植物细胞都有细胞壁细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。细菌只有核糖体一种细胞器。植物细胞比微生物细胞大,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞的特点：植物细胞直径一般约会10-200微米，平均直径比微生物细胞大30-100倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。,植物细胞培养和次生代谢产物生产,植物细胞培养的方法 按培养规模：小规模培养和大规模培养 按培养方式：平板培养法、悬浮培养、看护培养、微室培养等；按培养基类型：固体培养和液体培养 按要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。,一、植物单细胞培养技术,固体培养：是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。固定化培养：属于固体培养，指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中，培养液呈流动状态的无菌操作技术。液体培养：也是在微生物培养基础上发展起来的。可分为:振荡培养、旋转培养、静止培养、纸桥培养 细胞悬浮培养：属于液体培养，指植物细胞或小细胞团在液体培养基中大规模进行培养。,一、植物单细胞培养技术,振荡培养箱,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离 1)机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。优点：细胞不受酶伤害。缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。1969年，Gnanam和Kulandaivelu用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离机械法,第一种方法：用刀片刮叶片,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离机械法,第二种方法：叶片研碎、离心,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离 2）酶解法：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。优点：最有效的一种方法。缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。1968年，Takebe等用该方法分离烟草叶肉细胞成功。,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离,一、植物单细胞培养技术,机械法和酶解法比较,机械法,酶解法,细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。,细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。,1.单细胞的分离,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离3）由培养组织分离单细胞：指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶有利。这是分离单细胞通常采取的方法。诱导产生愈伤组织；愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物,外植体,连续继代培养愈伤组织,筛选未分化和易散碎的愈伤组织,振荡培养,过滤和离心,理想的细胞悬浮液,建立单细胞悬浮液的程序,诱导和筛选愈伤组织,促使细胞游离，获得单细胞,一、植物单细胞培养技术,1.单细胞的分离愈伤组织诱导法,一、植物单细胞培养技术,建立悬浮细胞培养系,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术1）平板培养法指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。此法是Bergman(贝格曼，1960)首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术 1）平板培养法 a.步骤 制备单细胞悬浮液 调制悬浮培养液中的细胞密度 倾倒平板(植板)密封、标记和培养 b.优劣 平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均匀，也便于定点观察，缺点是容易造成培养细胞的通气不良。,一、植物单细胞培养技术,平板培养法,2.单细胞培养技术1）平板培养法,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术1）平板培养法 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率 每个平板接种的细胞总数,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术2）看护培养与饲养层培养法看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。谬尔（Muir，1953）首创此法。该方法的优点是简便易行，效果好。但不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。饲养层培养：是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。饲养层培养具体方法有四种：饲养细胞与靶细胞混合。前者位于下层，后者相反。一起培养于液体培养基中。双层滤纸植板培养,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术3）液体浅层静置培养法指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术4）细胞悬浮培养法指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。优点：能大量提供比较均匀的细胞。细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快。适合大规模培养，生产有价值的活性代谢产物。,必须指出,悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术5）微室培养是指在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。此法是De Ropp(戴洛普，1955)首创，Torry(托瑞，1957)、Jones(琼斯，1960)改进。优点是便于在显微镜下进行少量单细胞活体连续观察。,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术微室培养,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术微室培养,一、植物单细胞培养技术,2.单细胞培养技术微室培养,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,平视图,微室培养要求：微室内不能有气泡。微室的厚度最好不要超过20微米，盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。观察时要保持温度和培养时一致。,二、植物细胞的大规模培养,悬浮培养固定化培养,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 植物细胞大规模悬浮培养的优点 1）可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收。2）可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害。3）保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果,二、植物细胞的大规模培养,5,S形曲线,滞后期,对数生长期,直线生长期,缓慢期,静止期,1,2,3,4,5,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 1)细胞悬浮培养技术 成批培养：又称分批培养，指在一个固定容积的培养基中培养细胞，当培养基中主要的营养物质耗尽时生长就停止。连续培养：在培养过程中由于不断注入新鲜培养基，故培养液中营养物质能够连续得到补充，培养物的容积一般是恒定的。半连续培养：指新鲜培养液不是连续加入，而是在隔一定时间后把培养液倒出部分，同时再加入新鲜培养液。这相当于成批培养频繁地进行再培养。,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 2)悬浮细胞培养的同步化方法同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期，使细胞保持相对一致的细胞学和生理学状态，便于研究细胞分裂和细胞代谢。物理方法：(1)体积选择法：又称分选法;(2)冷处理法 化学法:(1)饥饿法;(2)抑制法;(3)不连续密度梯度离心法,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养3)悬浮培养中细胞生长量的计算 细胞计数法：用血球计数板，以cells/ml表示。细胞体积：将细胞离心于离心管内，测定细胞层所占体积。细胞密实体积（PCV）法 细胞鲜重或干重 有丝分裂指数,二、植物细胞的大规模培养,1.植物细胞的悬浮培养 4)细胞活力测定 相差显微镜观察法 FDA染色法：在活细胞中，FDA被裂解，荧光素被释放出来，在活细胞积累，而在死细胞中不能积累。伊凡蓝染色法：与FDA相反，死细胞能摄取染料。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养 细胞固定化定义 指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。细胞固定化具有以下意义1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。4）有利于进行连续培养和生物转化。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养植物细胞固定化技术包埋法：将细胞包埋在多也载体内部使细胞固定的技术。常用的固定剂包括：如海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、交叉藻聚糖、明胶、聚丙酰胺等。吸附法：利用细胞能吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力进行培养。常用的载体多为多孔性惰性物质材料，如聚氨酯泡沫、尼龙网、生物膜等。,二、植物细胞的大规模培养,2.植物细胞固定化培养,三、植物细胞生物反应器,植物细胞生物反应器是指用于植物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应器和固定化培养生物反应器两种。,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器1)机械搅拌式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器2)气升式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器3)鼓泡式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器4)转鼓式生物反应器,三、植物细胞生物反应器,1.植物细胞悬 浮培养生物反应器,三、植物细胞生物反应器,2.植物细胞固定化生物反应器1)流化床生物反应器2)填充床生物反应器3)膜生物反应器,填充床与流化床反应器,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,初级代谢产物（Primary metabolites）是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。在不同种类的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。初级代谢产物的合成无时无刻都在进行着，任何一种产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动，甚至导致死亡。次级代谢产物（Secondary metabolites）是通过次级代谢合成的产物，是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型酚类化合物黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类：结构：C6-C3-C6生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。功效：为治理心血管疾病和高血压的药物成分。醌类化合物：结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物，种类：苯醌、萘醌。功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型萜类化合物 组成单元：异戊二烯 合成途径：异戊二烯途径 种类：单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。萜类化合物已超过2万种。单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值。倍半萜：抗疟疾药物青蒿素。二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。三萜皂甙：人参皂甙。甾体皂甙：薯蓣皂甙。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物次生产物的主要类型含氮化合物 包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷 种类：5500种以上 分布：双子叶植物 生物碱的作用：药用，植物抗毒素。目前对生物合成途径研究比较清楚的有：烟草的烟碱(nicotine)、毒藜碱(anabasine)和吡咯生物碱(pyrrolizidine alkaloid)，毛茛科植物的小檗碱(berberine)，曼陀罗属植物的莨菪碱(tropine)和东莨菪碱(scopolamine)。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植物中分离得到的一种双萜类化合物化。C47H51NO14，分子量：853.90 用途：具有良好的抗癌活性，尤其对晚期、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分显著的疗效。制备途径：直接从红豆杉中提取；化学全合成；化学半合成；植物细胞培养；内生真菌培养。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,有效途径：红豆杉细胞培养制备紫杉醇 从树叶获取细胞，利于资源保护（红豆杉属于濒危保护植物）。细胞培养不受地理环境影响：地理环境、病虫害和季节等因素的影响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产。利用生物技术提高目标产物含量，实现大规模培养制备。（1）可以通过进行红豆杉细胞的筛选，获得超过原植株紫杉醇含量的细胞。（2）易于在生物反应器中满足最佳条件，进行大规模、高密度地培养。（3）可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究，利用代谢调控使细胞定向合成有用次生代谢物。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005%左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。无法满足市场需求，破坏宝贵资源、不可持续发展。化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率仅4-5%。成本高。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,紫草素：为植物色素之一种（萘醌）。存在紫草植物中。抗癌、抗炎、抗菌等。日本在1983年用大规模紫草细胞培养来生产紫草素。灵芝酸：是灵芝中除多糖外另一类具有广泛生理活性的物质,被证明具有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、抗肿瘤等活性。人参皂苷：对人体神经系统、循环系统、血液系统等具有广泛的生物活性。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,植物细胞大规模培养生产次生代谢物的基本程序：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系；筛选高产细胞系(株)；在生物反应器中进行大规模培养，获得所需次生代谢物；,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,1.优良细胞系(株)的建立和筛选 细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,1.优良细胞系(株)的建立和筛选 细胞株指标（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,1.优良细胞系(株)的建立和筛选 适合工业生产用细胞株的一般筛选流程 愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,1.优良细胞系(株)的建立和筛选 适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：(续)细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,1.优良细胞系(株)的建立和筛选细胞株定向富集驯化 例如：激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,2.扩大培养：为大规模生产作准备3.大型生物反应器培养4.次生代谢物的提取、纯化和测定,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 1)生物因素-细胞株 稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 1)生物因素-细胞凋亡 细胞凋亡（Cell apoptosis），也叫程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。关键是要保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累，这可以通过采用合适的培养工艺来实现。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 1)生物因素-细胞团 植物细胞容易聚集成团，每个细胞团一般由4-300个细胞组成，大小因植物细胞种类不同具有较大差异，例如：烟草细胞团直径大约在350-1000m，长春花细胞团在40-2000m之间。细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 1)生物因素-生物合成机制 次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 2)化学因素 主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等。营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积聚目标产物。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 2)化学因素-前体 前体（precursor）：指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 2)化学因素-诱导子 狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子。从来源上可以分为外源性和内源性诱导子，后者是指在外界信号刺激下细胞合成的物质。从性质上可以分为生物与化学诱导子。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 2)化学因素-反馈抑制 植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。例如：直线式反馈控制（Straight linear feedback contro1)：当末端代谢产物达到一定浓度时，就会抑制该代谢途径，通常是抑制第一种酶的活性。可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技术可以克服。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 3)物理因素 主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。（1）光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。（2）温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在25左右进行。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素 3)物理因素（3）pH pH会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。植物细胞液体培养的pH 变化范围在56 之间，最佳的起始pH在5.55.8 之间。如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素4)工程技术问题（1）培养液的流变特性 由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素4)工程技术问题（2）气体传递 与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素4)工程技术问题（3）搅拌与剪切力 为了加强气液固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐受剪切力的能力不尽相同。烟草细胞和长春花细胞在涡轮搅拌器转速150 rpm和300 rpm时一般还能生长。培养桔叶鸡眼藤细胞时，涡沦搅拌器的转速应低于20 rpm。剪切力影响的克服可以通过低剪切力的生物反应器开发与耐受高剪切力的细胞株筛选来实现。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,影响次级代谢产物的因素4)工程技术问题（4）泡沫与器壁表面粘附性 与微生物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。消泡剂、机械去除。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径 培养设备：选择或设计合适的生物反应器。培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养、起始材料的选择。培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步法培养（第1步细胞生长；第2步产物积累）、毛状根培养技术、冠瘿培养技术、反义技术）。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径选择适宜的起始材料种类、部位栀子（Gardenia jasminoides）胚轴 银杏子叶 当归根 红豆杉 幼嫩的茎茜草 叶柄,培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径前体（precursor）的应用作用：提高目的产物产量。选择对某一目的产物来讲可能有多种前体物质同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。多数前体物质对细胞生长本身并不十分有力注意前体浓度。过量也可能产生反馈抑制。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径激发子（elicitor）的应用也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子。非生物激发子：如辐射、金属离子、茉莉酸类似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激发子外源激发子：菌丝、微生物机体提取物及微生物产生的多糖、蛋白和脂肪酸等内源性激发子：来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径激发子（elicitor）的应用激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关,激发子对南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇的影响,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径 两相培养(two-phase culture)指在植物细胞培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外，并被另一相所吸附。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径,两步培养在生长培养基中培养细胞在生产培养基中积累产物,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径器官组织在反应器中的培养技术发状根（毛状根，hairy root）培养生产次生产物，已在人参、丹参、紫草、颠茄和黄芪等植物中进行了探索性研究，并取得良好进展。冠瘿组织培养用于次生产物的生产。,四、植物细胞培养生产次生代谢产物,5.提高次级代谢产物产量的途径毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。,1934年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根,思考题,1.获得植物单细胞的方法？各有什么优缺点？2.植物单细胞的培养方法有哪些?3.什么是悬浮细胞培养?固定化培养?4.植物细胞大规模培养体系的建立程序是怎样的?5.预习第六、七章,