专题五 课题1：DNA的粗提取与鉴定.ppt.ppt
课题1 DNA的粗提取与鉴定,专题5 DNA和蛋白质技术,课题重点与难点,课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。,课题重点与难点,1、尝试对植物组织或动物组织中的DNA进行粗提取2、了解DNA的理化性质；3、理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。,课题背景,当你制作DNA双螺旋结构模型，模拟DNA的复制，绘制DNA指导蛋白质的合成过程图之后，对DNA的结构与功能一定有了不少的了解。但是，仅仅从课本上了解DNA，就像“雾里看花，水中望月”，总隔着个一层。本课题为你提供了从生物体内直接提取DNA的机会。,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理性质或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是利用DNA与RNA、蛋白质和脂肪等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。首先让我们来了解这些大分子的物理化学性质。,1、DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。,问题思考与讨论：,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,2、DNA在酒精溶液中的溶解性,3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,（二）、DNA的鉴定原理,1、二苯胺：DNA与二苯胺（沸水浴）会被染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂；原理：,2、甲基绿：绿色,二、实验设计,（一）实验材料的选取,2、材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,1、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,下面的材料适合做DNA提取吗？为什么？你打算选用什么实验材料，你也可以同时使用2-3中实验材料，最后比较哪种材料中DNA含量更高？,动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,旁栏思考：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？通过渗透作用和玻璃棒的搅拌，使鸡血细胞及细胞核吸水涨破，释放出核物质。,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜。,2、植物细胞,旁栏思考：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有 利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.,旁栏思考：如研磨不充分，对实验结果有怎样的影响？,在这一步的设计中，你可以通过设置对照实验来探究生物材料与洗涤剂、食盐用量的最佳比例，看看不同的用量比例对结果会产生怎样的影响；你也可以探究不同的洗涤剂，如洗发香波、沐浴液、洗洁精来提取DNA时，会产生不同的效果。,旁栏思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的DNA,需要将滤液作进一步处理。下面是去除杂质的三个方案，你可以根据实际情况选用一种，或者自己设计方案。,旁栏思考：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,旁栏思考：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：核蛋白、多糖、RNA等杂质。,（四）DNA的析出与鉴定,将处理后的滤液过滤，加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。,1、DNA的析出,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。,案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破,鸡血细胞做实验材料的原因?,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,1、准备鸡血细胞液,过程：,柠檬酸钠作用:,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆.,取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。,防止血液凝固,2、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液（其中溶解有DNA）。,提取鸡血细胞的细胞核物质：释放核物质,讨论：,答：由于渗透作用，细胞会吸水以至涨破。,（1）为何要加入蒸馏水？加蒸馏水后细胞会有何变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：可加速血细胞和细胞核的破裂，释放核物质。注意沿一个方向快速搅拌，不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜（实质为各种细胞碎片）等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA。,溶解细胞核内的DNA：2 mol/L的氯化钠溶液,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA溶解在溶液中。然后，用放有纱布的漏斗过滤，取其滤液。,缓慢加入蒸馏水，用玻璃棒不停地轻轻沿一个方向搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时氯化钠为0.14 molL，此时DNA溶解度最低，大量析出，如果继续加入过量蒸馏水，粘稠物会因为溶解而减少）。,析出含DNA的粘稠物：加入蒸馏水析出,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出。,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层（4层）纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上，要粘稠物，滤液不要，滤液中含有其他可溶性杂质。,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。,提取含杂质较少的DNA：加入冰酒精析出DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出。,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察比较两支试管中溶液颜色的变化。,DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管颜色不变化。,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,答：整个实验共“两次蒸馏水，四次过滤，两次析出”,3、讨论：,两次蒸馏水：,第一次：细胞吸水胀破 第二次：使DNA黏稠物析出,此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出？分别在哪一步？,四次过滤：,第一次：DNA存在于滤液里第二次：DNA存在于滤液里第三次：DNA被留在纱布上 第四次：DNA存在于滤液里,两次析出：,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第二次：用冷却的95的酒精,1、以鸡血为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固；2、在植物组织中（如菜花）DNA提取，加入洗涤剂后，动作要轻缓柔和，否则容易产生大量泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺要现配现用，否则影响实验效果。,四、操作提示,1、你选用了什么实验材料？采用了怎样的实验方法步骤？鸡血细胞液；见三、实验案例；2、你提取出了白色丝状物吗？用二苯胺鉴定的结果如何？如果不是白色丝状物，说明杂质较多；二苯胺鉴定不呈现蓝色，可能提取的DNA含量低，或者是实验操作出现错误；3、你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。4、与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有什么不同？对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采取不同的方法，从多方面比较实验结果，如DNA纯度、DNA颜色、二苯胺显示的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。,五、结果分析与评价,本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTBA）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。请查阅资料，了解实验室提取纯度较高DNA的一种方法，与本课题中使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。,六、课题延伸,1、鸡血细胞做实验材料，一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，3、嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶，其作用是分解蛋白质，使提取出的DNA纯度较高4、预冷的乙醇溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解，二是降低分子运动，易于形成沉淀析出，三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂；5、洗涤剂等去污剂可以溶解细胞的细胞壁，破坏细胞膜，同时也能使蛋白质变性；6、在6075度条件下加温处理，蛋白质变性，而DNA结构不会受到破坏，提取纯度较高的DNA7、甲基绿能使DNA染成绿色,用到的一些基本原理,
