细胞对金属离子浓度的调控（PPT X页） .ppt

4 细胞内金属离子浓度的控制与应用,细胞结构透射电子显微镜观察,19,000,主要内容,金属离子的有益作用和毒性效应在严格调节之下的有益金属：铁毒性金属实例：汞金属离子梯度的产生细胞内离子浓度的测定,有益金属离子：Ca,Fe,Zn 1.浓度太低时，需要利用该离子的过程将受到不利影响，生物体产生金属离子的缺乏症；2.浓度适当时，满足生物体需要；3.浓度太高时，产生毒性效应，例如，过多的金属离子将结合到某一不恰当的部位时，阻碍了其他有益金属的结合。有害金属离子：Hg,Cd 没有特定的生物功能，当存在于细胞中时，产生较大的毒性。例如，在生物流体内生成不溶性的盐，参与降解蛋白质、核酸等生物大分子的水解反应，产生破坏性副产物，如羟自由基。,金属离子浓度和生理效应之间的关系,体内平衡：指有益金属离子的浓度保持在一个恰当的范围之内。解毒：指降低无益金属离子的有害浓度。体内平衡和解毒需要在金属离子的摄取、利用、贮存和排出过程之间有一个平衡，即代谢平衡。,实例1：铁,是所有生物体内的一种必需金属离子。主要作用包括传送分子氧、参与电子传递等。例如，铁缺乏时，满足不了血红蛋白合成的需要，将引起缺铁性贫血。也是常见的一般毒性物质。当生物体内铁超载时，过剩的金属离子将催化产生活性氧物种(reactive oxygen species,ROS)，损伤组织Fenton反应。,Fe,Oxygen-carrying Hemoglobin(血红蛋白）Metabolism enzymesEnergy ATP Cell growthDefense,Function,Biomarker,Oxygen-carrying capacityHemoglobin(血红蛋白）血色素 转铁蛋白铁蛋白红细胞体积,Endpoint,贫血免疫能力下降乏力发育迟缓,Iron input/output in balance,Faeces,Iron overload,“A million Americans have a potentially fatal disease iron overload.So why are we still focused on deficiency?_”Finch 1995Gene silenced gene基因沉默 in bone marrowDiets high content and availability of iron MeatPrescription of iron supplement Abuse and overdoseLife long blood infusion for thalasemia anemia地中海贫血 Therapy:Chelation;Gene therapy,Fe,Cancer risk Alzheimer disease（老年痴呆）Thalasemia（地中海贫血）/sickle cell anemia（镰刀细胞贫血）/,Iron overload/Excess Fe ion,Malaria/Sickle cell anemia/Thalassemia,thalassemia,Sickle cell anemia,malaria,gene mutationabnormal HbFe overload,贫血,输血,Iron overload,心力衰竭,肝细胞损伤,感染,血红蛋白突变,镰刀细胞贫血,地中海贫血,溶血,心肌细胞损伤,肝损伤,Pathological relation among Malaria/Sickle cell anemia/Thalassemia,实例2：顺铂,在血液中，Cl-浓度高(100mM)，以Pt(NH3)2Cl2形式存在，生物活性较低；扩散进入细胞，细胞内Cl-浓度低(320mM)，发生Cl-的取代反应，产生阳离子性水合物，最终与DNA结合成稳定的加合物。这些加合物是有害的，但是对肿瘤的有害程度大于对正常组织的有害程度，导致在生物体水平上的有益效应。,主要内容,金属离子的有益作用和毒性效应在严格调节之下的有益金属：铁毒性金属实例：汞金属离子梯度的产生细胞内离子浓度的测定,Ferricreductase,Fe3+,Fe2+,Fe2+,Fe2+,Hephaestin,Fe3+,1.Iron Transport in intestines,Fe2+,Fe3+,Transferrin,Apical surface,Basal surface,Gut lumen,Enterocyte cytoplasm,Blood plasma,Fe3+,Ft,Ferroportin1,DMT1,2.铁的溶解、传输和摄取,铁的溶解、传输和摄取是由转铁蛋白(Transferrin,Tf)完成的：血液中Fe3 FeTf 细胞内Fe3Tf与铁的结合常数高(K表观1020M-1)结合特点：Tf与铁结合的同时，也同一个阴离子(如碳酸根)结合；Tf与碳酸根的结合促进了与铁的结合，反之亦然。在细胞内，这个协同作用对于铁的释放可能是很重要的。,Tf,TfR,乳铁蛋白(Lactoferrin，人体内的转铁蛋白)由2个相似的球状域结构组成，这两个域由一段短链-螺旋相连接。每个域又由2个亚域结构组成，2个亚域间结合一个Fe。,当乳铁蛋白与铁结合时，亚域结构象一个铰链一样弯曲，紧夹在铁碳酸根单元上。,乳铁蛋白的活性部位结构,铁吸收进入细胞转铁蛋白受体(transferrin receptor)调节细胞内吞作用细胞内铁释放质子泵调节H+浓度细胞内铁的贮存铁蛋白,铁贮存蛋白铁蛋白(ferritin),24个亚基(444kDa)每个铁蛋白可结合4500个铁原子,Fe,Fe,Fe,铁蛋白中铁的配位环境,W1,W2,W3,W4,W5,3.铁摄取和储存的金属调节,转铁蛋白受体(TfR)铁的摄取铁蛋白(ft)铁的储存；当需要时，铁蛋白可以释放出大量的Fe3+供细胞所需。在哺乳动物中，细胞通过依赖金属的方式在翻译水平上调节铁蛋白和转铁蛋白受体的表达，进而控制铁的摄取和储存，使生物体内的铁水平达到平衡。,如果细胞内铁的含量较低，转铁蛋白受体mRNA更稳定，铁蛋白mRNA被相对翻译得较慢。在富铁条件下，转铁蛋白受体mRNA不稳定，铁蛋白mRNA翻译的速度显著提高。,铁调控元件(Iron Regulated Element,IRE)：蛋白mRNA上的一段核苷酸序列，形成茎环结构(stem-loop)。铁蛋白mRNA的5端存在一个IRE；转铁蛋白受体mRNA的3端存在几个IRE。IRE是IRE结合蛋白结合到mRNA上的结合部位。,铁调控元件,IRE结合蛋白,IRE结合蛋白(IRE binding protein,IRE-BP)：分子量约为90kD。当IRE-BP与铁蛋白mRNA上的IRE结合时，它将阻止mRNA翻译成蛋白质；当IRE-BP与转铁蛋白受体mRNA上的IRE结合时，将抑制mRNA降解，导致翻译进行。IRE-BP对IRE亲和性是受铁浓度调节的。在高铁水平下，IRE-BP与铁结合，对IRE有较低的亲和性；在低铁水平下，IRE-BP对IRE的亲和性增加。,IRE结合蛋白,通过铁离子浓度调节有关蛋白编码基因的表达,主要内容,金属离子的有益作用和毒性效应在严格调节之下的有益金属：铁毒性金属实例：汞金属离子梯度的产生细胞内离子浓度的测定,1.涉及汞解毒过程的酶,汞离子的毒性：汞离子对巯基具有较大的亲和性，这种相互作用以及伴随所形成加合物的稳定性，使得很多蛋白质和酶结构中的必需巯基失活；Hg(II)代谢产生一些毒性更大的有机汞化合物。细菌内降低汞毒性的两种酶：有机汞裂解酶和汞离子还原酶。,GSH,2.汞解毒基因的金属调节,汞解毒基因：有机汞裂解酶基因和汞离子还原酶基因。MerR蛋白：一种在转录上控制汞解毒基因表达的细胞内汞传感器。MerR是一种二聚的DNA结合蛋白，能专一性地与DNA部位结合。在缺乏结合汞的情况下(即汞离子浓度较低)，表现为调节它本身基因mer基因的转录。一旦结合汞后(即汞离子浓度较高时)，MerR将活化汞解毒基因的转录，最终解除汞的毒性。,汞与MerR的结合导致MerR-DNA复合物的结构变化，表现为DNA以33度角解旋，解旋的DNA更易与RNA聚合酶结合，激活RNA聚合酶转录活性。,MerR-Hg(II)配合物的结构：每个MerR二聚体能够结合一个汞离子。,汞离子浓度调节汞解毒基因的转录,主要内容,金属离子的有益作用和毒性效应在严格调节之下的有益金属：铁毒性金属实例：汞金属离子梯度的产生细胞内离子浓度的测定,离子泵,离子泵的功能是使离子穿越细胞膜发生转移，同时伴随着ATP与ADP的相互转化。由于离子泵能催化水解ATP或者利用ADP和无水磷酸盐(Pi)合成ATP，它们也被称为ATP酶。,ATP,ADPPi,X,X,离子梯度,细胞膜,离子通道,离子通道在离子梯度驱动下传递离子穿越细胞膜。与离子泵不同，通过离子通道传递离子时与ATP的水解和合成没有直接的联系。离子通道传递离子的能力受到闸门的控制，例如膜电位、外源性配体如神经递质的浓度或其他条件等。闸门允许通道将信息从一种形式转换成另一种形式。,膜电位膜两边电位之差,膜电位可以认为是由于膜两边离子浓度的差别所决定的每个离子的电位的总和。根据Nernst方程，浓度差决定电位：,V=(RT/ZF)ln(cout/cin),表 哺乳动物细胞内外游离离子浓度和平衡电位,Z离子电荷数cout细胞外的离子浓度cin细胞内离子浓度,电导,离子通道不允许所有的离子以同样的效率传递。相反，它表现出不同等级的离子选择性，例如，区别阳离子和阴离子；区别某个特定离子(如Na+)与其十分相似的离子(如K+)。离子通道对不同离子的选择性与离子通道的电导(单位：-1或S)有关。,电流电导膜电位,1.细胞膜内外离子梯度的产生,该反应涉及膜两边的电荷的净传递。每3个钠离子被传递到膜外就有2个钾离子被泵进膜内；ATP的水解是与离子传递紧密相关的过程。,离子梯度的产生是一个依赖能量的过程，所需的能量是由ATP水解产生ADP和Pi提供的。细胞膜内外Na+和K+梯度的产生是由离子泵Na+-K+ATP酶负责的。,注意：,在Na+-K+ATP酶作用下，依赖ATP提供的能量使3个Na+被传递到胞外，2个K+被泵进胞内,2.通过离子通道进行的离子传输,Na+-K+ATP酶能够以每秒100次的速度翻转，而离子通道是每秒能够传输106107个离子的蛋白质。离子通道有多种构象状态：开放构象，能够传送离子；关闭构象或失活构象，不能传送离子。主要介绍两种离子通道：乙酰胆碱受体一种受神经递质控制的通道 钠通道一种电压控制通道,在神经脉冲的刺激下，神经末端的轴突中含有乙酰胆碱的泡囊融化，将乙酰胆碱释放到突触间隙中，这些神经递质分子穿过突触间隙，与处于对面膜中的受体分子结合，引发离子通道的开启，从而将神经脉冲传递出去。乙酰胆碱受体是一种非专一性阳离子通道，对不同的阳离子没有选择性。在生理条件下，Na+是经过该通道的重要离子。,乙酰胆碱受体的生理学作用,乙酰胆碱受体的结构乙酰胆碱受体是一个巨大的糖蛋白，包含有5个亚基2。5个亚基围绕一个相对开放的中心核按五边型排列，中心核供离子通过。每个受体分子结合2分子的乙酰胆碱，每分子的乙酰胆碱结合在亚基上。,(a)一个亚基的结构示意图；(b)以电镜为基础的俯视图，示出五个亚基呈五边形排列；(c)截面图，示出包括离子通道在内的跨膜区域，上部为细胞外侧，下部为细胞内侧。,乙酰胆碱(ACh),乙酰胆碱受体离子通道开启作用与乙酰胆碱浓度及时间关系的模型示意图,膜片钳(patch-clamping)法测定离子通道的电导,记录图谱中向下的尖峰信号对应于单个离子通道的开启作用,电压调控钠通道,乙酰胆碱受体开放Na+进入膜电位升高膜的局部去极化钠通道开放(几个毫秒)动作电位(活动电位)钠通道闭合钾通道开放，膜重新极化,活动电位(a)和它的组成成分(b)该电位是由于钠离子进入细胞的电导与随后钾离子排出细胞的电导产生的,一个对电压敏感的钠通道假设示意图该分子由4个相似的单元组成，每个单元包括6个跨膜螺旋体和1个构成部分离子微孔的股绞状结构,钠离子通道阻断剂局部麻醉药,神经细胞膜的微小去极化作用通常会打开钠通道，发生钠离子的迅速和瞬息的流入。局部麻醉药可与神经细胞膜上的钠离子通道结合，增加膜被电刺激的阈值，使通透性降低，从而阻断了感觉神经冲动的产生和传导。,结构特点：含有弱碱性基团(pKa为89)，既可透入细胞膜，又可与钠离子通道结合；大多数局麻药是胺基醇酯，可被血浆中酯酶水解而失活可逆性麻醉作用。,主要内容,金属离子的有益作用和毒性效应在严格调节之下的有益金属：铁毒性金属实例：汞金属离子梯度的产生细胞内离子浓度的测定,细胞内钙离子浓度的测定：激光扫描共聚焦荧光显微镜,激光扫描共聚焦荧光显微镜Confocal,UV Laser,Kr-Ar Laser,Optical Mixer,Scanhead,Microscope,Computer,荧光探针检测胞浆游离Ca2+变化的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜。只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离Ca2+结合发出荧光。,荧光探针 激发波长发射波长Fluo-3-AM 488nm 525nmFura-2 340/380nm 476nmCalcium Crimson 588nm 611nmCalcium orange 554nm 575nmRhod-2 550nm 575nmCalcium Green-5N 506nm 531nmIndo-1 355nm 405nm,常用的测量细胞内Ca2+的荧光探针,Ca2+i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Kd=450nMFmin:细胞内无钙时的荧光强度(细胞外无钙+EDTA+A23187)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(细胞外1-2mmol/L钙+A23187),Ca2+浓度计算,定性计算:用荧光强度F表示Ca2+浓度相对变化,定量计算:,La3+引起NIH-3T3细胞内Ca2+水平升高和振荡,Confocal实时监测,Fluo-3-AM,Fluo-3,Ca2+,荧光,细胞,La3+引起G0期NIH-3T3细胞内Ca2+水平升高，但不能引起振荡。,Triol对VSMCs Ca2+i的影响,