荧光分析法基本概念.doc

精选优质文档-倾情为你奉上紫外可见吸收光谱一 紫外吸收光谱分析基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。二 紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： （1）形成单键的电子；（2）形成双键的电子；（3） 分子中非键电子即n电子。化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（）（）（n）（*）（ * ） ,是成键轨道，n 是非键轨道，* ,* 是反键轨道由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。二 紫外光谱的表示方法紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、k(吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2 , -NR2 , -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。2红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反，如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动，则称为蓝移。由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返回基态1. 振动驰豫 这一过程只能发生在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射跃迁。 2. 内转换 即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁3. 系间窜跃 有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易了4. 磷光 经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-410 s，称作磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光（phosphorescence）。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长。5. 荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态二、激发光谱和荧光光谱荧光检测光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。 激发光谱与荧光发射光谱的形成任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。 1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器），依次改变激发光波长（即调节激发单色器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同的是纵坐标。2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发射波长发射光谱与激发光谱的关系 1.发射光谱形状与激发光波长无关 由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪一个电子激发态无关。 2.发射光谱比激发光谱波长为长 由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁（振动驰豫、内转换）损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振动能级，再由此发出荧光。因此，荧光发射能量比激发光能量低，发射光谱波长比激发光波长长。 3.镜像对称 对于高度对称的有机分子，其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。解释：能级结构相似性 荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性，因而呈镜像对称。三、影响荧光产生及荧光强度的因素1.物质产生荧光的必要条件一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件： 1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有pp*跃迁）； 2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。荧光效率也称荧光量子产率，用Ff 表示。可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常，kF 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。2.影响荧光及其强度的因素跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率才能产生荧光。具有pp* 跃迁的分子才有强吸收。pp* 跃迁的e大。共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，具有共轭的pp* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。 苯萘蒽维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nmF0.110.290.36 刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大。 荧光物质（荧光素） 非荧光物质（酚酞）芴（=1.0） 联苯（=0.2）有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+ 等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。 8-羟基喹啉 8-羟基喹啉-铝取代基团 荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸电子取代基，可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如R、SO3H、NH3 等。温度 温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强度。 由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容易引起溶液温度升高，加之分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度改变。另外，有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下，还会发生光分解，使荧光强度下降。因此，试样不应长时间受光照射，只在测定荧光强度时才打开光闸，其余时间应关闭。在较高档的荧光分光光度计中，样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置，以使溶液的温度在测定过程中保持恒定。溶剂：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别，尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。 溶剂的影响可以分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应是指溶剂极性的影响。通常情况下，随着溶剂极性增大，pp* 跃迁所需的能量差DE减小，跃迁几率增加，从而使荧光波长长移，荧光强度增大。 一般而言， 探针激发态的偶极矩大于基态偶极矩， 当荧光基团被激发后， 溶剂的偶极子在激发态的荧光基团的周围重新定向而降低激发态的能量，溶剂的极性越大，荧光团激发态能量降低的越多， 因而从激发态跃迁回基态时发射的能量越低， 发射的波长就越长特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态改变，使荧光峰的波长和荧光强度都发生较大变化。如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的NH2基逐渐被NH3Cl基所代替，而NH3Cl基对萘环特征频率的影响小于NH2，因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。 pH值：溶液的酸度（pH值）对荧光物质的影响可以分两个方面： 1若荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺 无荧光（离子形式） 蓝色荧光（分子形式） 无荧光（离子形式）2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光配合物，溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。例如Ga3+离子与邻-二羟基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能产生荧光。而在pH67的溶液中，则形成1:2的配合物，不产生荧光。 总之，溶液pH值对荧光物质的荧光光谱、荧光效率及荧光强度均有影响。需通过条件实验找出pH与荧光强度的关系，确定最适宜的pH范围，以提高分析的灵敏度和准确度。 Fluorescence signaling mechanisms荧光响应机理1 Photoinduced electron transfer，PET典型的光诱导电子(Photoinduced electron transfer，PET)转移体系是由包含电子给体的受体部分R(receptor)，通过间隔基S(spacer，-CH2-)和荧光团F(fluorophore)相连而构成的。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所，受体部分则用来结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET mechanismFig1 The principle of guest recognition by PET fluorescent molecular probePET荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移到激发态荧光团(还原型PET)。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光解释Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET当电子给体被激发时，引入的电子受体就可作为淬灭剂，通过LUMO轨道的电子转移，引起荧光淬灭。Fig.2 Frontier orbital energy diagrams illustrating the mechanism of PET当电子受体被激发时，引入的电子给体就可作为淬灭剂，通过HOMO轨道的电子转移，引起荧光淬灭。PET应用到传感器上需要的条件：一、传感器分子中要包含一个荧光团，其应具有高的量子产率；二、还应包含电子给体（Electron Donor），可以发生向荧光团的 PET 过程；三、当结合目标分子（或离子）后，会引发或抑制电子给体与电子受体间的光诱导电子转移，引起荧光团荧光猝灭或荧光恢复，实现信号报告目的。基于PET过程的阴离子识别与传感PET选择性识别HPO4-的荧光传感器此分子为首例利用PET机理识别阴离子的荧光分子传感器。其以蒽为荧光团，多胺阳离子为阴离子的识别位点。在进行阴离子识别前，先对多胺进行部分质子化，残留一个自由氨基作为荧光团蒽的猝灭剂。当HPO42的加入后，其羟基与残余氨基孤对电子结合后，阻断了PET的发生，可使蒽荧光得到恢复，表现为受体分子荧光显著增强，实现在在pH = 6 的水中选择性识别磷酸氢根离子(HPO42 )。 PET过程被阻断选择性识别CH3COO-的荧光传感器PET受体分子以硫脲盐类为阴离子识别位点，荧光团为萘。在激发态时，会发生从萘向硫脲盐方向的PET过程， 致使萘的荧光被猝灭，在乙腈中， 阴离子如AcO与硫脲盐以静电吸引和多重氢键协同作用结合后，提高了硫脲盐的还原电位，阻断了PET的发生，荧光强度显著增强，可实现在水中识别HPO42和AcO，其与HPO42形成2:1的配合物。 选择性识别Hg离子-的荧光传感器PET受体分子3是选择性识别Hg2+的PET传感器。 萘酰亚胺是分子3的荧光团， 2，6-二胺甲基吡啶上的氮原子既是荧光团的猝灭基又是金属离子的结合位点，其半刚性结构可增强与金属离子结合的选择性。在pH=6.98的HCl-Tris缓冲溶液中受体自身的荧光较弱，荧光量子产率为0.007，过渡金属离子中的Zn2+、Cd2+、Ag+和Pb2+均能使3的荧光不同程度的增强(/0 < 3)， 唯有Hg2+使其的荧光增强17倍，其它金属离子的加入并不影响3的荧光行为。受体分子中的羟基可增加分子的水溶性， 可实现水相中的Hg2+ 选择性识别选择性识别Hg2+的荧光传感器PET同样为选择性识别Hg2+的荧光传感器，受体4以荧光素为荧光团，同时在受体中引入硫原子以增加与Hg2+的结合能力。在pH = 7的缓冲溶液中，受体4存在从苯胺到荧光素的PET过程，荧光量子产率仅为0.04。随着Hg2+的加入，苯胺到荧光素的PET过程被抑制，受体的荧光强度增加5倍，光谱略有红移。干扰实验表明除Cu2+外，其它金属离子的存在对Hg2+的检测并不干扰。 2 Förster Resonance Energy Transfer,FRET荧光共振能量转移(Förster resonance energy transfer，FRET)是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光团(Doner)的发射光谱和另一个荧光团(Aceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光团间的距离合适时(一般小于100)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。进一步讲，就是在供体的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。影响共振能量转移效率的因素一、供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠程度二、供体与受体间的距离按照Försters理论三、供体与受体的跃迁偶极的相对取向识别F-,HPO4-的荧光传感器受体分子7未结合阴离子时存在从芘（能量供体）到 2,3-二吡咯-喹喔啉（能量受体）的共振能量转移，以 325nm（芘的吸收带）激发，观察到位于 495nm的2,3-二吡咯-喹喔啉的强荧光发射峰。随着阴离子（F或 HPO42）的加入，2,3-二吡咯-喹喔啉的荧光强度减弱，且其吸收光谱也发生变化，表明 FRET 过程受到抑制。 通过对比实验，发现跟单独的 2,3-二吡咯-喹喔啉相比，受体7 通过FRET进行传感的灵敏度有所提高。 选择性识别Al3+的荧光传感器受体分子8利用结合前后供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠程度的不同，从而选择性进行Al3+的传感。分子中邻羟基苯基三唑自身不发荧光，与Al3+结合后荧光有所增强（尽管仍很弱），但其发射光谱与香豆素343的吸收光谱重叠程度大为增加，能量转移效率提高，达到信号放大之目的。在甲醇-水（1:1）的pH 5.0缓冲溶液中，以350 nm光激发受体8（邻羟基苯基三唑的吸收峰）， Al3+ 的加入使香豆素343的荧光增强7倍，检测限为50 nM，其它金属离子除Cu2+和Fe3+使受体8荧光猝灭外，对测定无影响。 3.激基缔合物（excimer）如果两个相同的荧光团(主要是多环芳烃)之间的距离和位置合适，当其中一个荧光团被激发以后就会和另外一个处于基态的荧光团形成激基缔合物(excimer)，其荧光发射光谱的特征表现是原来单体的发射峰减弱或者消失，取而代之的是一个新的、强而宽的、长波长的无振动精细结构发射峰。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离约3.5,因此荧光团间的距离是激基缔合物形成和破坏的关键利用各种分子间作用力改变两个荧光团之间的距离和取向，如用结合客体前后单体激基缔合物的荧光光谱变化就能够表达客体被识别的信息。萘、蒽、芘等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基复合物，常常用于此类探针的设计中。 激基缔合物的形成过程受扩散控制，因此单体浓度与溶剂粘度是缔合物形成过程中的决定因素。当单体溶于烷烃溶剂且浓度低于105 mol /L时，通常观测到的为单体荧光。若受体分子中有两相同的荧光团，其相对距离与受体和客体的结合有关，如受体分子结合上客体后，分子构型发生变化，促进激基缔合物的形成（图 6）或破坏了单体本身的激基缔合物结构，因此可通过单体与 excimer 间的荧光强度比值来进行客体的识别。 图6. 客体与受体分子结合后促进激基缔合物的形成 基于monomer/excimer的阴离子识别与传感分子以胍基为阴离子识别位点，芘为信号报告基团，在甲醇中，其只发射单体的荧光，随着焦磷酸根离子的加入，导致单体荧光猝灭和excimer荧光的形成和增强，原因在于焦磷酸根离子与受体发生自组装作用。其它阴离子无此现象，因而该受体可选择性地识别焦磷酸根离子作为磷酸根离子传感器，此分子采用了与上例相反的传感模式。它采用钳型结构，以酰胺键为识别位点，可选择性地识别磷酸根离子。在四氢呋喃中发射双重荧光，长波长的excimer荧光被认为来自不同侧链的芘分子间的激发态相互作用。磷酸根离子的加入与酰胺NH氢键结合，改变了分子构型，使芘分子间距离增大，导致excimer荧光减弱，单体荧光增强。 识别Zn2+的荧光传感器巧妙地应用变构原理。在受体分子中，金属配体（-NH2）与荧光团（芘基）处于六元环结构的稳定的平伏键构象结构中。未结合阳离子时分子的荧光主要为单体荧光； Zn2+的加入，诱使-NH2采取直立键构象，使之构象发生翻转，荧光团芘也只能以直立键方式分处上下两端，促进excimer的形成，导致excimer荧光增强，单体荧光猝灭。与前一分子相反， 此分子在未结合阳离子时，分子中的两个芘基彼此靠近、重叠，主要发射 excimer长波长荧光，阳离子（Hg2+）与之配合后改变芘基的空间位置， 破坏之前的excimer结构，所以观测到受体分子单体荧光增强，而excimer荧光被猝灭。该受体对Hg2+ 的选择性很好，而对其他金属阳离子的响应很弱。更多excimer探针4Intramolecular Charge Transfer，ICT当直接连有供电子基(通常是氨基)的荧光团和一个吸电子基共轭连接时，在光的激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。典型分子内电荷转移荧光分子探针就是荧光团上连有强的吸电子基和供电子基的推-拉电子体系。ICT荧光分子探针的受体往往是推-拉电子体系整体中的一部分，相反，当荧光团上的受体在吸电子基团一端，也就是说，在推拉电子体系中拉电子的一端时，和客体结合后，会增大体系推拉电子的能力，增大电子的流动性，吸收光谱红移，摩尔消光系数增大。原理上，荧光光谱的位移和吸收光谱的位移方向一致。除了光谱的变化外，也能观察到荧光量子产率和荧光寿命的变化。所有这些光物理性能的变化决定于客体的大小和电荷多少。当荧光团上的受体(如氨基)在供电子基团一端时，和客体结合后会减少这个供电子基团的供电能力，从而导致体系共轭程度降低，吸收光谱蓝移，并伴随着摩尔消光系数的减小。当荧光团上的受体在吸电子基团一端，也就是说，在推拉电子体系中拉电子的一端时，和客体结合后，会增大体系推拉电子的能力，增大电子的流动性，吸收光谱红移，摩尔消光系数增大。问题：分子处于激发态为什么会发生电子转移而导致正负电荷分离呢？这是由分子激发态的性质决定的。首先，激发态的分子较基态具有更大的反应活性，体现在其氧化电位下降和还原电位提高，因此易于发生电子的得失，为电子转移提供条件。其次，当电子给体与电子受体位于分子内的共轭体系中时，无论是给体被激发或是受体被激发，都会诱导从电子给体到受体的电子转移过程。随着电子转移的进行，分子内会发生正负电荷的分离，表现为分子偶极距的增大。 处于激发态上的分子内电荷转移态分子是不稳定的，具有正负电荷复合趋向而回到基态，要是这个过程为辐射跃迁，就会伴随 ICT荧光发射。分子电荷转移态的稳定性受外界环境的影响较大， 凡是能稳定正负电荷分离的因素将会降低电荷转移态的能量，导致 ICT荧光光谱红移（例如溶剂效应），反之则会导致ICT光谱蓝移氮杂冠醚有着双重身份：既是推拉电子体系中的电子给体，又是探针分子中的识别基团。当冠醚与Ca2+络合时，由于金属离子的拉电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的供电子能力，因此其吸收光谱发生较大的蓝移。荧光光谱也发生蓝移，但比吸收光谱蓝移得幅度要小。这是由于光诱导电荷转移减少了冠醚上氮原子的电子云密度，这个氮原子由于极化变为非配位原子。因此，光激发诱导冠醚上氮原子和金属离子之间的作用减弱或消失，从而使荧光光谱发生较小的蓝移。加入Cd2+后，体系的颜色从绿色变为蓝色，而且荧光发射波长发生蓝移(531nm到487nm)，这是由于Cd2+直接与分子结构中的-NH结合，减弱了-NH的供电子能力；而加入Zn2+后，体系的颜色从绿色变为黄色，而且荧光发射波长发生红移(531 nm到538 nm)。实验进一步研究pH滴定 Zn2+配合物的图谱，结果表明此结构中的-NH基团首先要脱去质子，才能与Zn2+ 配合，从而导致分子结构-NH的供电子能力增强。这两种相反的ICT过程使之能够选择性的测定Cd2+ 和Zn2+ 。分子中含有两个供电子基团-NH-和两个吸电子基团-C=O，受光激发，-NH-上的电子向-C=O转移，形成ICT过程。在乙醇水溶液(乙醇:水=4:6)中加入Cu2+，体系的最大荧光发射波长蓝移50 (从525 nm到475 nm)。而且随着Cu2+浓度的增加，475nm处的荧光发射逐渐增强，525 nm处的荧光强度逐渐降低，两处的荧光发射强度比值与Cu2+浓度呈线性相关。加入Cd2+后，体系的颜色从绿色变为蓝色，而且荧光发射波长发生蓝移(531nm到487nm)，这是由于Cd2+直接与分子结构中的-NH结合，减弱了-NH的供电子能力；而加入Zn2+后，体系的颜色从绿色变为黄色，而且荧光发射波长发生红移(531 nm到538 nm)。实验进一步研究pH滴定Zn2+配合物的图谱，结果表明此结构中的-NH基团首先要脱去质子，才能与Zn2+ 配合，从而导致分子结构-NH的供电子能力增强。这两种相反的ICT过程使之能够选择性的测定Cd2+ 和Zn2+ 。Twisted Intramolccular Charge Transfer,TICT在荧光寿命期间，与发色团单键相连的助色团(通常是与发色团相连的氨基)会发生分子内的扭转，使得构像发生了变化；另有一种是以双键相连的，旋转后构型发生了变化。旋转的动力来源于电子激发后受体(aceeptor)的吸电性，扭转后的电子云分布将更加有利于系统的稳定，这种扭转将有利于电荷的完全分离。所形成的激发态称为TICT态，是完全的电荷分离。Principle of twisted intramolecular charge transfer，TICT在NMC5 和JULCN 分子中，氨氮原子被固定在苯环平面上，仅观察到 LE 荧光；而在 CBQ 和 MMD 分子中，二甲氨基平面被固定与芳环平面垂直或因邻位甲基的空间位阻使其扭转而与芳环平面几乎垂直，仅观察到 CT 荧光。基于TICT机理的离子传感5.Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT含有分子内氢键的分子，光激发时其质子酸性提高，易于发生质子转移。可发生分子内激发态质子转移的物质一般含羟基或氨基，受光激发时，质子从羟基或氨基转移至邻近的与之形成氢键的原子上（一般能形成五元环或六元环，距离不超过2Å），由之前的醇式结构转变成酮式结构。由于光激发所形成的酮式异构体只在激发态时 （而不是基态）较原醇式结构稳定， 故光异构体的荧光较原分子的荧光位于长波长处ESIPT mechanism for benzazole dyes在pH为7.2的缓冲溶液中荧光峰位于460nm，Zn2+加入后，使其荧光蓝移至405nm，这是由于Zn2+配位后导致磺酰胺NH脱质子，抑制了激发态质子转移，质子转移荧光消失。由此可实现荧光比值法测定Zn2+。 酮式 烯醇式 L=solvent于450nm处发射酮式异构体的荧光峰,加入Zn2+后，结构中的-OH与Zn2+键合，抑制了ESIPT过程的发生，因此体系的荧光发射波长蓝移至404nm。而且，随着Zn2+浓度的增加，体系在450nm处的荧光发射逐渐减弱，在404nm处的荧光强度逐渐增大，二者的荧光强度比值I404/I450与Zn2+浓度在8.0x10-4-4.0x10-3mol/L范围内呈线性关系。6Through-Bond Energy Transfer，TBETTBET能量体系与FRET能量体系不同，通过TBET的能量传递不要求能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱有一定程度的重叠，它是能量供体与能量受体经过共轭键连接，但是能量供体与受体不共平面。其能两种能量传递模式的示意图量传递效率与供体与受体的扭转角和连接的键性质有关。(a) Through-space and (b) through-bond ET cassettesTBET探针前面介绍了六种常见的激发态过程的荧光发射机理及其在离子识别中的应用，下面表格对这六种传感模式在分子结构、发光机理、作用通道以及光谱变化四个方面进行归纳和小结。 Excitestate processStructure requireMechanismInteraction channelSpectral phenomenaPETNon-conjugate flexibleElectron transferThrough spaceFluoroscence quenching of the fluorophoreFRETNon-conjugate flexibleLong range dipole-acceptor interactions induced energy transferThrough spaceFluoroscence quenching of D,emission from AMonomer/ExcimerNon-conjugate flexible-electron stacking interactionThrough spaceChange in the ratio between momomer and excimer emissionTICTconjugate rigiditycharge transfer twisted structureThrough bondChange in the ratio between LE and TICTESIPTconjugate rigidityProton transfer Through bondChange in the ratio between normal and ESIPTTBETconjugate rigidityLong range dipole-acceptor interactions induced energy transferThrough bondFluoroscence quenching of D,emission from A由此可见，对于同一种目标物的识别，有不同的荧光传感模式可供使用，因此我们可以根据不同的研究体系进行合理选择。例如 PET、FRET、excimer 模式受溶剂极性影响小，于是可以进行水相中的离子识别，但其分子中一般含有稠环芳烃等荧光团，具有较大的生物毒性，因此不适合于生物体系中的传感。 ICT和 ESIPT模式受溶剂极性影响大，用于质子性溶剂（如水相）中的传感困难较大，但其具有较大的 Stock 位移，可以有效的避免散射光对荧光测定的影响，具有好的发展前景和较大的发展潜力。 专心-专注-专业