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第十四章 微生物制药技术 Microbial Medicines,微生物学的奠基人伟大的巴斯德,我国的传统发酵产品酱油、醋、腐乳等享誉世界我国的酿酒已经有4000多年的历史我国的酱油距今已有3000年的历史1857年巴斯德证明发酵是由于微生物的作用,密闭式发酵罐,第一节 发酵技术,一、发酵的概念什么叫发酵？原始概念：果汁或麦芽谷物受酵母菌作用产生二氧化碳及能量的过程。现代概念：将所有通过微生物或动植物细胞或经过生物工程改造的“工程菌”培养制备工业产品或转化某些物质的过程。,二、微生物发酵类型（一）根据微生物发酵过程是否需要氧气分类1、需氧发酵2、厌氧发酵,（二）根据微生物发酵规模的不同分类1、浅层发酵（表面培养法）2、深层发酵（深层培养法）,（三）根据微生物发酵培养基物理状态不同分类1、固体发酵2、液体发酵,1.微生物菌体发酵 是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。2.微生物酶发酵 酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。3.微生物代谢产物发酵 微生物代谢产物很多。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质和糖类等是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。,（四)、根据微生物发酵产品类型不同分类,4.微生物的转化发酵 微生物的转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。5.生物工程细胞的发酵 是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。此类发酵的产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。,（一）在医药工业上的应用1.生产出了种类繁多的药品2.发酵工程对医药工业的一个重大贡献应用发酵工程大量生产的基因工程药品，有人生长激素、重组乙肝疫苗、某些种类的单克隆抗体、白细胞介素2、抗血友病因子等。,三、发酵医药产品1、抗生素类 抗生素是一类由微生物产生的在低浓度下具有抑制或杀死其他微生物作用的化学物质。继Fleming发现青霉素后，最杰出的抗生素先驱是美国放线菌专家Waksman，他与同事在1941年从放线菌培养液中找到紫放线菌素。接着他又在1944年发现了第一个用于临床的从放线菌产生的抗生素链霉素。由于Waksman开拓了寻找新抗生素来源的途径，使人们在仅10年左右的时间内相继发现了众多的抗生素：如1947年找到第一个广谱抗生素氯霉素和由细菌产生的多粘菌素；1948年发现了金霉素；1949年发现了新霉素；1950年发现了制霉菌素和土霉素；1952年发现了红霉素；1953年发现了四环素等。到目前为止，世界上已筛选出的抗生素已达9000种以上，应用于临床治疗的在百余种左右（不包括半合成抗生素）。,2、维生素类药物 目前采用微生物技术生产的维生素类药物及其中间体有维生素B2（核黄素）、维生素B12（氰钴氨素）、2-酮基-L-古龙酸（维生素C原料）、-胡萝卜素（维生素A前体）、麦角甾醇（维生素D2前体）等。,3、氨基酸类 目前氨基酸主要用于生产大输液及口服液，有些氨基酸尚有其特殊用途。如精氨酸盐及谷氨酸钠亦用于肝性昏迷的临床抢救，解除氨毒。L-谷氨酰氨用于治疗消化道溃疡，L-组氨酸亦为治疗消化道溃疡辅助药等。,4、核苷酸类药物 以微生物发酵法生产核苷酸类物质是60年代后逐步发展起来的。核苷酸类物质和氨基酸等类似，是微生物的初级代谢产物，它们在生物体内受到严密的调节和控制，因此，用于工业生产的产生菌都是经过选育的突变株。用微生物发酵技术生产的核苷酸类药物及其中间体有肌苷酸、肌苷、5-腺苷酸（AMP）、三磷酸腺苷（ATP）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、辅酶A（CoA）、辅酶I（CoI）、二磷酸胞苷（CDP）、胆碱等。,5、医疗用酶 以微生物作为酶源具有生产周期短，成本低的优点。通过环境改变或遗传变异，有可能大大提高酶的活性和产量。基因工程技术、蛋白质工程技术的发展，使得微生物体可生产其自身没有的，甚至是自然界不存在的特殊蛋白质和酶，大大扩展了微生物发酵技术的应用领域。酶工程技术的迅速发展和应用，也极大地促进了对微生物酶的研究和开发。目前可用发酵工程技术生产的治疗用酶有：链激酶、胶原酶、脂肪酶、纤维素酶、天冬酰胺酶、葡聚糖酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶等。,6、甾体类激素 用微生物所进行的甾体转化主要有羟化、脱氧、加氢、环氧化等反应以及侧链或母核开裂反应等。目前可的松、氢化可的松、泼尼松、地塞米松及确胺舒松等甾体激素化学合成工艺中，已有反应可用微生物转化来实现，并有良好的发展前景。,发酵工程的应用,（二）在食品工业上的应用主要包括以下三方面。第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。第二，生产各种食品的添加剂。第三，帮助解决粮食问题。,谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径,谷氨酸是味精的主要成分,第三节 菌体制剂一、中药菌体制剂1、灵芝2、冬虫夏草,二、药用酵母三、微生态制剂,谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径,谷氨酸棒状杆菌在一定的条件下能够利用环境中的营养物质来合成谷氨酸。,在工厂里是怎样应用谷氨酸棒状杆菌来生产谷氨酸的？,1、选择菌种,是不是所有的谷氨酸棒状杆菌都可用于谷氨酸发酵生产呢？我们应该选育什么样的谷氨酸棒状杆菌作为菌种呢？,只有选择细胞膜通透较强，在细胞内不积累谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌做菌种才有可能获得大量的谷氨酸。,2、培养基的配制,有了菌种用什么样的培养基去培养呢？培养基应满足微生物生长所需要的碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等营养需求。这种培养基从组成成分和物理性质上看属于哪种培养基?从物理性质上看是液体培养基，从化学成分上看是天然培养基。,3、灭菌,配制好培养液后，是否可以立即加入菌种？不能需要进行灭菌,将培养液投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌,4、接种,是否可以将所选择的优良谷氨酸棒状杆菌直接加入发酵罐中？大规模的发酵生产需要大量的菌种，应先经过多次扩大培养用于生产的菌种应选择处于哪个时期的谷氨酸棒状杆菌？对数期,5、发酵,发酵过程中应该注意控制好哪些条件？温度pH氧气培养过程中不断进行搅拌的目的是什么？_使空气形成细小气泡，迅速溶解在培养液使培养液和菌种充分接触，提高原料的利用率,谷氨酸棒状杆菌是好氧菌,6、分离提纯,温度30-37C，pH7-8，经过28-32h，培养液中就会产生大量的谷氨酸50-100g/L提取出谷氨酸用适量的Na2CO3溶液中和过滤浓缩离心味精,发酵工程的概念和内容,（一）发酵工程的概念采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或者直接把微生物应用于工业生产的一种新技术。,发酵工程的概念和内容,（二）发酵工程的内容菌种的选育培养基的配制灭菌扩大培养和接种发酵过程产品的分离提纯等,菌种的选育,要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品，最重要的是要有优良的菌种。,怎样才能得到优良的菌种呢？,如果生产的是微生物直接合成的产物,可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。,如果生产的是一般微生物不能合成的产品,可用基因工程、细胞工程的方法对菌种的遗传特性进行定向改造，以构建工程细胞或工程菌，从而达到生产相应产品的目的,培养基的配制,要进行发酵生产，有了优良的菌种还需要有与菌种相适应的培养基。在配制培养基时应该注意哪些事情呢？（1）目的要明确。根据不同的菌种，应选择不同的材料配制培养基。配制的培养基应满足微生物在碳源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面的营养要求。（2）培养基的营养要协调，以利于产物的合成。（3）pH要适宜。,灭菌,发酵工程所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程中不能混入杂菌。这是为什么呢？在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响。例如：如果在谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。如果在青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解掉。,灭菌,要在发酵前对培养基和发酵设施进行严格的灭菌处理。怎样才算灭菌彻底呢？用高温、高压的方式，杀死所有杂菌的胞体、芽孢和孢子。,扩大培养和接种,在大规模的发酵生产中，需要将选育出的优良菌种经过多次扩大培养，让他们达到一定数量以后，再进行接种。接种过程防止杂菌污染。,发酵过程,将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行控制。发酵过程中要随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时，还应对发酵条件进行严格控制。,发酵过程,哪些条件能影响菌体的发酵呢？发酵生产中温度、pH、溶氧量、转速等对发酵过程有重大影响。（哪些影响？）想一想：发酵过程中温度升高的热量来源？哪些因素会影响pH值？溶氧量的控制？,分离、提纯,菌体本身，如酵母菌和细菌等采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来代谢产物采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。,7、酶抑制剂 临床上应用较早的酶抑制剂是由棒状链霉菌产生的-内酰胺酶抑制剂。-内酰胺酶能水解青霉素等-内酰胺类抗生素中的酰胺键，从而使这类抗生素失活，这是细菌对这类抗生素产生耐药性的主要原因。棒酸等-内酰胺酶抑制剂自身抗菌活性不强，但它们与-内酰胺类抗生素联合使用时，却能显著地增强后者的治疗效果。目前两者的复方制剂已广泛应用于临床。,另一类由微生物产生的酶抑制剂是-羟基-甲基-戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂。1976年日本远藤等报道从桔青霉的代谢产物中发现一个具有抑制HMG-CoA还原酶活性的物质ML-236B（compactin），此后，在红色红曲霉、土曲霉中相继发现活性更强HMG-CoA还原酶抑制剂，后证实其主要成分为同一物质，即洛伐他丁。1983年Serizawa等报道，通过微生物转化ML-236B而获得一个新的羟基化的化合物，称为普伐他丁。目前发现的HMG-CoA还原酶抑制剂有数十个，其中已有三个作为降血脂药物应用于临床。这类药物针对性强、疗效显著、毒副作用少、耐受性好而受到广泛重视和好评。实际上目前开发中的微生物来源的酶抑制已涉及降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症等各种药物领域，这也是当前微生物药学研究中的热门方向,8、免疫调节剂免疫调节剂包括免疫抑制剂及免疫增强剂。环孢菌素A是第一个在器官移植中广泛应用的免疫抑制剂。自1983年应用于临床后，器官移植发生了一场革命，极大地提高了、心、肝、胰和骨髓在常规基础上移植的成功率。到目前为止已有近30个属于不同化学类型和不同微生物来源的免疫抑制剂。从微生物来源看，真菌、链霉菌、稀有放线菌和细菌均能产生不同化学结构类型的免疫抑制剂(从海绵中也已分离出免疫抑制剂)。尽管从微生物次级代谢产物中发现免疫增强剂的机会比免疫抑制剂要少，但在20世纪70年代末发现的bestatin具有较强的免疫增强作用。它被应用于临床研究后，发现它对多种肿瘤患者有免疫治疗作用。这也促进人们从微生物代谢产物中寻找新的免疫增强剂。,