04 实验四 植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.ppt

植物DNA的提取与鉴定,实验四,实验原理,真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白,实验原理,在浓氯化钠溶液（12 molL）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠溶液（0.14 molL）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。,在核蛋白溶液加入氯仿异戊醇，振荡，使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。用苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内。,去除蛋白质的方法,化学因素 核酸在pH4.011.0稳定，否则就变性降解。物理因素 DNA是长链线状分子，强机械作用会使DNA分子断裂。酶的作用 DNA酶会降解DNA分子。,破坏DNA完整结构的因素,紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度,核酸的紫外吸收峰260nm,蛋白质280nmDNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.01ug/mL的DNA溶液,吸光度A260=0.020 1ug/mL的RNA溶液，A260=0.022-0.024 1.0个A260相当于50ug/mL的DNA,40ug/mL的RNA。,实验步骤,10mL CTAB分离缓冲液加入50mL 离心管中，在65水浴中预热。取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动混匀，65保温30分钟。加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，4000 rpm离心10分钟。,用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL 70乙醇中，浸泡洗涤10分钟用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥将DNA沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液中,DNA纯度和浓度鉴定,取100uL DNA溶液（剩余的DNA溶液放在-20保存），用TE缓冲液稀释20，50和100倍，测定A260和A280根据A260/A280判断DNA纯度计算提取的DNA总量,试 剂,CTAB分离缓冲液,2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）1.4 mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA 100 mmol/L Tris-HCL(pH8.0)0.2%巯基乙醇,CTAB,CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）阳离子去污剂,它不仅能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸CTAB复合物。核酸CTAB复合物可溶于0.7mol/L NaCl的高盐缓冲液。,异丙醇氯仿-异戊醇（24：1）液氮70%乙醇,TE 缓冲液,10mmol/L Tris-HCL（pH7.4）1mmol/L EDTA,思考题,本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？吸取样品、抽提应注意什么？为什么？提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？,