生物材料教学PPT组织工程学概述.ppt

第11章 组织工程学概述,1.组织工程的提出,提出,1.提出,从机体内获得少量的活体组织,将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解和可吸收的生物材料按一定比例混合，使其粘附在生物材料上形成细胞-材料复合物,用特殊的酶将细胞（种子细胞）从组织中分离出来并在体外进行培养扩增,将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官,2.定义：运用工程科学和生命科学的原理及方法，从根本上认识正常和病理的哺乳动物组织和结构功能的关系，并研究生物学的替代物，以恢复、维持和改进组织的生物替代物。,3.基本原理,组织工程研究的基本原理及方法：(1)、直接移植或体外器官制作的杆细胞培养(2)、研制生物相容性好，能为细胞生成、增 殖提供三维空间的生物材料支架(3)、种植形成细胞-生物材料复合物，植入 机体病损部位(4)、材料降解，细胞增殖，形成新的组织和 器官,2.组织工程的三要素,假体,支架,种子细胞,生长因子,1.种子细胞,种子细胞是组织工程研究的基础，也是制约组织工程发展的瓶颈。主要原因：许多组织细胞（如软骨细胞、内皮细胞）的供体来源和扩增能力均非常有限，无法通过取少量组织体外扩增细胞来构建大块组织，很难实现“小损伤修复大缺损”的组织工程基本设想。干细胞来源广，增殖力强，又能定向诱导分化为多种目的细胞并形成相应组织，因此，应用干细胞能够实现“小损伤修复大缺损”的基本设想，这为解决组织工程种子细胞问题提供了良好机遇。,种子细胞包括组织细胞和干细胞，组织细胞包括：,种子细胞来源,（1）病人的自体细胞；最佳的细胞来源是病人的自体细胞，将其进行体外一定数量的扩增后用于组织工程研究。由于自体细胞具有体内移植后不引起免疫排斥反应等优点，因此受到研究人员的广泛青睐，是目前组织工程研究中应用最为广泛的一种细胞来源。尽管如此，自体细胞作为种子细胞来源也存在明显局限性，如自体细胞来源有限，在体外难以大量扩增，并且存在去分化现象等。（2）动物的异种细胞,干细胞,人胚胎干细胞和组织干细胞的研究进展为从根本上解决制约组织工程的细胞问题提供了可能。到目前为止,将胚胎干细胞分化而来的定向细胞用于治疗的实验已有报道,如将由胚胎干细胞衍化而来的少突神经胶质细胞移植到骨髓鞘缺陷型(-)大鼠胚胎的大脑脑室中,这些细胞会广泛分布,并形成髓鞘环绕在宿主的神经轴突周围。髓鞘缺陷型大鼠是人类遗传性髓鞘疾病的模型,进一步的工作便将衍化胶质细胞移植至动物模型的骨髓,发现髓鞘生长良好。这些实验都为将来人类疾病的攻克奠定基础。,干细胞,按来源来分：,（1）胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）,胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体；,（2）成体干细胞（Adult stem cells）,成体干细胞的进一步分化是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。,种子细胞的分离和培养,为支架材料提供生命源泉、并能形成组织的功能细胞称为种子细胞。依据其来源可分为自体、同种异体和异种细胞。自体细胞可由活检或穿刺所得到的组织进行分离培养,获得所需要的功能细胞;同种异体细胞主要来自胚胎、新生儿和成体组织;异种细胞主要来自于猪、牛等动物。其中干细胞研究最为突出。,种子细胞的作用,2.支架,1）定义 能与组织活体细胞结合并能植入生物体的三维结构体2）支架材料最基本的特征与活体细胞直接结合：羟基磷灰石（HAP）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）网、尼龙网与生物系统结合：植入生物体的组织工程化软骨、骨、肌腱、牙、肺、肝、肾等组织与机体的结合具备细胞相容性和组织相容性（统称生物相容性）,3）支架材料材料：钙磷材料、多聚物（合成的和自然的）要求：微孔结构、化学组成、可降解、力学性能作用：在结构上加强缺损部位的强度；阻碍周围组织长入；作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖的支架；利用与细胞整合素以及受体的相互作用，作为一种可溶的细胞功能调节因子；作为细胞、生长因子和基因的生物载体。,细胞支架材料(多孔磷酸三钙生物陶瓷材料),3.生长因子,1）定义 在细胞间传递信息并对细胞生长具有调节功能的一些多肽类物质，它可以促进或者抑制细胞的增殖、分化、迁移和基因的表达。2）分类 按受体的结构分类，成纤细胞生长因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）和肝细胞生长因子（HGF）等3）将生长因子用于组织工程技术中时，有两种不同的方式：生长因子直接复合到支架上或者在支架构建之后再与其符合；在支架上同时移植能分泌生长因子的细胞。,3.组织工程研究方法,1）研究的核心内容：合适的种子细胞来源、可供细胞粘附生长的生物支架或细胞外基质、用于促进组织再生长因子和组织的相容性等问题。2）利用组织工程方法生成活体替代组织或器官常可使用三种策略，可根据目标组织或器官而定。,4.组织工程相关生物材料,组织工程相关的生物生物材料主要有两种：天然的材料：胶原合成聚合物：开始于20世纪80年代中期优点：1）生物相容性 2）可复制性3）可生物降解4）通过与多聚物结构一体化来连续地输送营养和激素,表 可用于组织工程的聚合物材料,各种各样的可生物降解材料已用作组织支架，包括陶瓷和多聚物。陶瓷主要用于骨组织工程，再次运用了羟基磷灰石多孔配方以承载来源于骨膜或骨髓的骨祖细胞。多聚物支架的典型形式：纤维网、多孔海绵或泡沫、或是水合凝胶。在纤维网和泡沫中更常使用的多聚物包括线形聚酯，例如，聚乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）和聚已内酯（PCL）；聚乙二醇（PEG）以及天然聚合物如胶原和透明质酸（HA）。,组织工程的临床应用,1、细胞移植2、损伤修复：3成形外科的应用：小耳畸形修复、面部重建、鼻造形、面部整容、气管缺损修复。,5.组织工程的应用及展望,损伤修复,组织工程的提出和建立虽然只有10多年的时间,但已在国际上得到迅猛发展。在美国,组织工程研究开展最早,进展较快。在80年代,美国首先由国家科学基金组织资助建立了一系列组织工程实验室。1995年筹建组织工程学会,并出版了正式刊物“组织工程学”。美国集中了相当数量的研究机构(包括,)、大学(包括,等)、公司(如,等)。,发展-国外,在美国,目前已经形成价值60亿美元的产业,并以每年25%的速度递增。培育的骨骼、软骨、血管、皮肤以及神经组织正在进行体内实验。再造的肝脏、胰脏、乳房、心脏、手指、角膜等正在实验室里生长成形。其中一种名为的组织工程化皮肤产品已经实现商品化,正式进入临床应用。软骨组织工程产品已进入临床实验,在几年内就可应用于临床,临时的助肝装置正在进行临床实验,组织工程化骨产品不久也将面世。德国、日本、加拿大、奥地利、瑞士和英国等也开展了与组织工程相关的研究工作。,发展-国外,在我国,组织工程学研究虽然起步较晚,但近几年国家对组织工程研究给予了高度重视,并逐步加大研究经费的投入,我国青年学者曹谊林博士在的实验室中,于1996年在世界上第一个成功地在裸鼠身上培养制成了人形耳廓软骨支架。目前,国内已见到有关软骨、肌腱、血管、皮肤和神经等组织以及微囊化胰岛细胞、肝细胞等研究报道。这些研究目前均处于实验研究阶段,要形成产品用于临床尚需时日。,发展-国 内,5.组织工程的应用及展望,组织工程存在的问题：目前对组织工程化组织的科学本质还缺乏深刻的认识。对影响组织形成主要相关因素的作用机制缺乏深入的了解。具有复杂功能器官的构建研究才刚刚起步。,组织工程化皮肤,皮肤是人体最大的器官，其主要起屏障作用，以隔离外部环境，其重要功能包括体液平衡、体温调节、免疫监视和自我伤口愈合等。皮肤损伤主要是热损伤，仅在美国每年大约就有250万人烧伤，其他原因包括慢性溃疡、创伤、皮肤肿瘤切除或其他皮肤疾病。传统的修复方法有：自体植皮、同种异体植皮、异种植皮和人工合成代用品的应用。但存在供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点。,表10-1 皮肤的生理机能,伤口修复是一个可溶性递质、血管成分形成、细胞外基质和基质细胞互相影响和协调的协同过程。伤口处理主要是尽快封闭伤口，形成功能性和具有一定美观性的瘢痕。目前，一种生长因子和几种皮肤替代物已经投放市场，作为治疗难愈性溃疡的二线选择。,创伤愈合过程,组织对创面的即刻反应是形成血凝块，阻止进一步出血；同时还会释放一些炎症细胞因子，这些细胞因子可以调节该区域的血流量，并吸引淋巴细胞和巨噬细胞来对抗感染；后期刺激血管形成和胶原沉积。创面愈合过程包括了很多组织因子和成分的相互作用。慢性创面愈合能力较差主要是由于因子之间的不平衡造成的，并不是缺乏任何一个特殊因子所致。表皮和真皮的反应由真皮成纤维细胞和表皮的角质形成细胞通过自分泌和旁分泌以及炎症细胞因子来调控，这些因子调控着角质和形成细胞的生长和分化、前炎症反应、血管增生和细胞外基质的沉积。,组织工程皮肤,组织工程皮肤:由活性细胞接种在支架材料上形成的组织工程化皮肤，有真皮层或同时具有真皮层和表皮层，因此是一种活性生物敷料。工程化皮肤结构需要复制的关键特性有：一种具有恰当帮助真皮修复和支持表皮生长能力的真皮或者间质成分；一层具有容易使创面达到生物覆盖能力表皮；一层可以使屏障特性快速重建的表皮；一个准许免疫系统、神经系统和血管系统生长的环境；一种能在结构和附加功能（例如降低长期瘢痕形成和色素重建）方面正常化的组织。,1.表皮替代物和支持基质,重建表皮的方法:细胞悬液全层皮肤替代物。例如：聚硅氧烷膜、活的表皮角质形成细胞1975年，Rheiwald和Green等以3T3细胞作为滋养层采用共培养的方法培养出人类表皮角朊细胞获得成功。1981年，OConnor等首次应用CEA法在体外培养出适于移植的人自体表皮细胞膜片，表皮细胞膜片附着良好。尽管CEA技术是大面积烧伤治疗的一大进步，但单纯CEA移植技术存在一些缺点：如耗时长；细胞膜片菲薄易碎，难以操作；移植到创面后，接受率低，极易造成移植物脱失；即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦，容易发生水泡，造成残余创面。,2.真皮替代物和支架材料,真皮替代物的研究是随着CEA的发展而不断引起人们的关注的。研究进展：人尸体皮肤（发生免疫排斥反应、引发潜在感染的可能、移植物的来源以及原料质量的差异性）去细胞的真皮乳头层深（部真皮和更表浅得乳头层真皮在结构上存在不同）较深层的网状真皮组织工程已经研究了通过使用支架和活细胞来引起肉芽组织形成的可能性。1980年，Yannas和Burke制成一种人工真皮替代物，网状皮片的获得率也提高到85%95%。Integra Artificial Skin、Biobrane、Dermagraft、Dermagraft-TC等人工真皮相继产生。,3.复合人工皮肤,复合人工皮肤:用组织工程方法对所取小量皮肤组织进行消化、分离、表皮细胞、成纤维细胞分别培养和扩增、达到一定细胞数量后重组成全层皮肤组织（包括表皮层及结缔组织）。组织工程皮肤包括两种活的细胞成分：位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞，不仅具有正常皮肤的部分功能，种植后不易变形，而且具有良好的修复皮肤创伤的作用。Apligraft(又称作Graftskin)是第一种商品化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种由Organogenesis公司注册生产的产品已在加拿大和美国获准用于临床治疗静脉性溃疡。,组织工程皮肤的临床应用,组织工程皮肤是美国FDA批准最早用于临床的产品。第一代产品为单层上皮细胞移植，虽然愈合较快，但瘢痕较多，且易发生瘢痕挛缩。第二代产品则研制成功了真皮层，成为具有双层结构的新一代产品，其临床效果也得到明显改善。其代表产品有Dermagraft-TM，Dermagraft-TC和Apligraff（TM）。,我国伍津津教授领导的组织工程实验室于1992年开始人工皮肤研究，建立了毛囊器官型培养模型、活性皮肤替代物的培养模型及动物移植模型，研制出壳多糖的凝胶制备方法。夏照帆教授牵头进行“皮肤替代物的研制及临床应用”课题研究，他们所建立的体外构建含表皮细胞层的活性复合皮，已经通过动物实验，并成功在临床上进行了试用。临床观察结果显示，所制备的真皮支架和复合皮可以促进创面愈合，缩短愈合时间，减轻瘢痕增生，改善创面外观。,展望,用组织工程皮肤移植物作为常规手段治疗皮肤创面已经变为现实，有着极其巨大的社会和商业价值以及广阔的研究和临床应用前景。现有的几种组织工程化皮肤虽然在治疗烧伤及慢性溃疡上取得了长足进步，但对组织工程皮肤的研究着重于对表皮和真皮的研究，对毛囊和皮脂腺的研究相对较少。,骨组织工程,在美国每年有100万人接受相关治疗。现行的骨修复技术包括自体和异体骨移植技术，但由于数量和价格的限制，大多数人得不到应有的治疗。右表列出了美国骨移植的状况。,骨组织的解剖生理学,骨是一种结缔组织，是由特殊的细胞和蛋白纤维混合于水，无机盐和碳水化合物所形成的胶冻状的基质中而构成。骨组织并不是完全僵硬不变的，骨在生长过程中和损伤以后，会不断地分解和再建，重塑其形状并使之匀称。无机盐约占骨组织质量的65%；有机物约占35%，主要由骨胶原纤维和粘多糖蛋白组成，它使骨有韧性和一定的弹性；无机物主要有磷酸钙和碳酸钙。,骨主要由3部分构成：骨膜骨质骨髓右图是长骨的结构示意图。,1）骨膜由致密结缔组织构成，含有丰富的血管、神经、淋巴管和大量的成骨细胞。对骨有营养和保护作用，在骨损伤后修复和骨生长发育过程中也具有重要作用。2）松质骨位于骨的深部，由许多骨小梁构成。骨小梁呈针状或不规则的细杆状，均由若干层骨板平行排列而成。扁骨的板障、长骨骨骺的大部分和骨干内表面的一小部分都是由松质骨构成。3）密质骨分布于长骨骨干和骨骺的外侧部分。由规则排列的骨板及分布于骨板内、骨板间的骨细胞构成。有以下4种骨板：外环骨板：位于骨干表面；内环骨板：位于骨髓腔面；骨单位：又称哈佛系统，位于内、外环骨板之间；间骨板：位于骨单位之间。,骨细胞存在于骨板中或骨板间呈椭圆形的骨陷窝中，骨陷窝的结构是扁的并沿着骨板层平行排列。成骨细胞在骨生长时盖在新形成的骨基质的表面，起到使骨基质沉积的作用，而且可使有机磷化物分离出的磷酸根离子发生钙化。其胞体较大，呈柱状或椭圆形，分布在骨质的表面。破骨细胞由多核巨细胞组成，直径100m，含有250个核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。破骨细胞的数量较少，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。,图为成骨细胞、骨细胞、破骨细胞结构模式图,骨组织没有再生能力，它的再生主要依据骨膜。当骨受伤时，骨膜内层细胞 肉芽组织 结缔组织 纤维软骨 松质骨 密质骨,骨组织工程,定义：一门应用工程学和生命科学的原理和方法，以载体结合被分离细胞，并能在宿主体内降解释放细胞,形成新的有功能组织的科学。基本方法：取少量自体组织，在体外分离、培养细胞，将一定量的培养细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，再将此细胞-支架复合物植入体内或在体外继续培养，通过细胞的生长繁殖、相互粘附、分泌细胞外基质，形成具有一定结构和功能的组织和器官。目前骨组织工程的研究主要包括：种子细胞的体外培养；细胞种植基质材料的研究开发；组织培养中各种因子的调控作用,1）种子细胞来源：皮质骨、松质骨、骨膜、骨髓、骨外组织以及胚胎干细胞。皮质骨、松质骨、骨膜来源的成骨细胞能表达成骨细胞表型且骨膜中含有较多的骨原细胞,而骨原细胞具有分化潜能，可以分化为成骨细胞。但它们的成骨细胞存在较多的缺陷,如取材困难、来源有限、扩增能力有限及免疫排斥等。胚胎干细胞具有分化为三个胚层的能力，体外培养后可分化为肠上皮细胞(内胚层)、软骨、骨、平滑肌、横纹肌(中胚层)及神经细胞(外胚层)等,可以大量扩增和定向诱导为具体干细胞，但是存在免疫排斥较强的缺陷。,2）细胞种植基质作用：种子细胞提供了粘附、增殖、分化的空间结构和生长模板引导组织再生,控制组织或器官的性状。分类方法：以结构分：封闭式和开放式;以形态分：纤维状、海绵状、凝胶状等；以来源分：天然生物材料和人工合成生物材料。天然生物材料主要有胶原、脱钙骨基质及经物理化学高温处理的动物骨、纤维蛋白、硫酸软骨素、壳聚糖、藻酸盐几丁质等。人工合成生物材料可以分为人工合成无机材料和人工合成可降解有机高分子材料。,理想的支架材料具有的特征：三维多孔的连接网络，有利于细胞生长、养分传输和代谢产物的排放；生物相容性和可降解性好，降解速度和吸收速度可以调控，以适应细胞或组织在体内体外的生长；化学表面适合细胞的粘附、增殖和分化；机械性能与所植入组织的要求相匹配。仿生学材料就是近年发展的趋势，RGD 序列或基因与支架整合后可提高细胞的粘附与增生。,3）生长因子作用：具有诱导和刺激细胞增殖，维持细胞存活等生物效应的蛋白类物质；促进细胞增殖，组织或血管的修复和再生。在骨创伤早期，生长因子主要启动成骨细胞活性，促进成骨，后期作用逐渐减弱，但也参与骨的生长调节。髓基质中含有多种生长因子：骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子、酸性成纤维生长因子、类胰岛素生长因子和、血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素-1等。,BMP由Urist于1965年发现并提出，是目前已知最有效的促骨生长因子.能诱导间充质细胞分化为成骨细胞和骨细胞，促进钙化作用，产生钙化的骨基质.它有很多种克隆，其中以BMP-2诱导骨化活性最强。许多学者利用基因工程将生长因子基因转入骨髓基质细胞，使细胞增殖同时表达定向分化所需要生长因子，通过自体分泌的方法来调节细胞增殖和分化。,4）组织工程化骨在早期的骨组织工程研究中，一系列的研究都是围绕让细胞锚着的基本特征。例如：当有些细胞在传统培养条件下培养时，比如在塑料或胶原包被的培养皿中，基因转录被抑制，细胞特异mRNA减少，而结构相关基因的mRNA成倍增加。与之对照，当在富含黏连蛋白和IV型胶原的细胞外基质上培养时，有些类型的细胞表现出更长的寿命并保持数种细胞的特异功能。,目前，用组织工程骨修复骨缺损的研究，已从取材、体外培养、细胞到支架材料复合体形成等都得到了成功。例如：用自体骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物修复兔下颌骨缺损，结果表明：术后3个月，单独珊瑚组及空白对照组缺损未完全修复；珊瑚-骨髓组和珊瑚-rhBMP-2组及单独骨髓组已基本修复了缺损；而骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物组在2个月时缺损即可得到修复。带血管蒂的骨组织工程：将骨细胞种植于预制带管蒂的生物支架材料上，将它作为一种细胞传送装置。,组织工程骨的构建分为：体内构建和体外构建两种形式。体内构建：将成骨细胞-支架复合物植入体内，修复骨缺损。体外构建：通过体外组织培养的方法应用水降解支架材料，接种成骨细胞，构建骨组织。,5）组织工程化软骨重点主要集中在两个领域：骨科和整形重建外科。在骨科领域，研究者主要的兴趣在于关节软骨的修复，1994年，Brittberg等在人体进行的自体软骨细胞移植的相关报道更加激发了研究者的兴趣。应用组织工程化软骨植入皮下环境存在一些并发症。与关节环境相比，在皮下或肌内植入物引起的免疫反应要强得多。,为了扩大组织工程软骨应用的可能性，在体外扩增细胞是构建支架结构的重要环节。对新的工程化组织的要求：在功能上要与用在多聚物基质上的细胞类型匹配；与研究的动物种类匹配。,骨组织工程的临床应用,骨组织工程的临床应用尚处于起步阶段。Vacanti等利用患者自体骨膜成骨细胞与天然珊瑚复合，用于1例36岁患者左手拇指指骨的再造。Quarto等用组织工程骨治疗3例长骨缺损的患者。杨志明等应用自体骨髓基质干细胞、同种异体骨膜来源的成骨细胞复合同种异体骨在人体内构建组织工程骨，并对52 例病人多个部位的骨缺损、骨不愈合进行了修复。,展望,应用组织工程学原理修复骨缺损是一种全新、具有前景的道路，其涉及生命科学、工程学、细胞生物学、免疫学、材料科学等领域，是目前研究的热点。主要表现在：细胞的来源、保存和在移植环境下细胞组织的生长；多聚生物材料的研究；生长因子与种植细胞及可降解材料整合后修复骨缺损组织的研究。,需要解决的问题：明确细胞在体外培养中分化、增殖的调控机制；加强可降解材料整合后修复缺损组织的研究；明确诱导因子对成骨细胞的作用，掌握成骨细胞的最佳培养密度和迅速增殖；建立起成骨细胞库及大规模的成骨细胞培养体系；改善细胞-材料相互作用，研究开发优良的基质材料，解决人工聚合材料远不能满足临床标准的问题；解决新生组织不能完全替代原有组织的功能问题；加强新生组织和基因转入的新生组织体内移植方式的研究。,