第十章氨基酸发酵.ppt

1,第十章 氨基酸发酵工艺学,第一节 氨基酸发酵生产概论,氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，由发酵所生成的产物氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立在对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累。,1、氨基酸构成蛋白质的基本分子单元。碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,一、氨基酸简介,2、氨基酸的用途,（1）食品工业：强化食品：赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中。增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸。甜味剂：苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯，甜味是蔗糖的150-200倍),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,（2）饲料工业：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料，添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。（3）医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。,（4）化学工业：谷氨基钠作洗涤剂.丙氨酸制造丙氨酸纤维（合成高分子化合物）能保持皮肤湿润的润肤剂焦谷氨酸钠和质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料。甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸可制表面活性剂、缓冲剂和抗氧剂等,表3-8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力,3、氨基酸生产的历史,氨基酸生产首先从谷氨酸开始19l0年日本味之素公司采用提取法大量生产味精1936年美国从甜菜废液中提取谷氨酸1956年日本用糖质原料发酵谷氨酸成功，完全取代了原来的水解法。1960年发酵法生产了赖氨酸，同年用合成法生产dl蛋氨酸。1962年谷氨酸的合成法生产成功1966年采用醋酸原料生产谷氨酸，此后石油发酵谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸等也获得成功目前氨基酸几乎都可应用发酵法生产。,我国味精生产始于1923年，上海天厨味精厂最先用水解法生产1932年沈阳开始用脱脂豆粉水解生产味精1964年上海味精厂和有关科学研究单位协作，开始采用发酵法生产味精，现在全国已普遍采用 目前除味精外，还生产赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等十多种氨基酸。,生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡.在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。2000年,世界氨基酸产值可达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,4、氨基酸的生产方法,发酵法：直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。添加前体发酵法：如用邻氨基苯甲酸，生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸。酶法：利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸。,提取法：常用毛发、血粉等蛋白质原料水解，从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：合成法获得DL-蛋氨酸、不对称合成法获得L-氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。,传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。,第二节 氨基酸发酵菌株的育种,是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一,发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵 代谢控制发酵：是用遗传学或其他生物化学的方法，有目的在分子水平上改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。,1、用野生菌株的方法,分离的野生菌株具备积累产物的特性，可用于直接发酵（产率低）。如谷氨酸发酵。通过转换发酵，可延伸获得其它产物。主要采用改变培养条件。如谷氨酸发酵中改变铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵。,2.用营养缺陷变异株的方法,通过诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起调控作用。如用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，谷氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，异亮氨酸缺陷菌株的脯氨酸发酵。,3.类似物抗性变异株的方法,用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。,高丝氨酸脱氢酶,例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸生物合成中（图5-16所示），选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍，能积累14g/L苏氨酸的突变株。,4.体内及体外基因重组的方法,基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。,5、基因工程菌-,通过基因工程技术，构建理想的工程菌株,第三节 谷氨酸生物合成及其发酵生产调控,我国与国外谷氨酸发酵生产比较,菌种性能：我国产酸5-6，转化率45；日本10-12，转化率55，菌种产酸低1倍。菌种单纯，不能对付噬菌体污染，日本十多个不同种属上千株菌轮换使用。工艺和过程控制：我国低糖和中糖发酵，日本高糖发酵并流加、提高罐压，保证溶氧。对温度、压力、空气流量、蛋白质、溶氧采用计算机控制。计算机控制产酸提高10-20，高糖和流加发酵提高产酸和设备利用率。发酵罐的大型化和控制自动化。成本与原料：我国发酵粮耗高，水、电、气消耗高。日本非粮研究如糖蜜、醋酸、正构烷烃、甲醇已实现产业化。,一、谷氨酸的生物合成途径及其代谢调节,异柠檬酸脱氢酶,1、糖酵解途径（EMP）2、磷酸已糖途径（HMP)3、三羧酸循环(TCA环)4、乙醛酸循环（DCA环）,（一）谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径）,5、二氧化碳固定反应,在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：,6、-KGA的还原氨基化反应,苹果酸酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶,CO2固定反应(丙酮酸羧化支路),（二）谷氨酸生物合成的调节,谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶柠檬酸合成酶,1、优先合成,在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。,所以，正常代谢不积累Glu,2、谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节,3、柠檬酸合成酶的调节,柠檬酸合成酶,TCA的关键酶，受能荷调节，谷aa反馈阻遏，乌头酸反馈抑制,细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当-酮戊二酸过量时,将对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成-酮戊二酸。,4、异柠檬酸脱氢酶的调节,6、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,PEP受天冬aa反馈抑制，受谷aa和天冬 aa反馈阻遏,5、-酮戊二酸脱氢酶:,谷氨酸产生菌中先天性的丧失或微弱。,（三）谷氨酸生产的代谢调控-（理想途径具备的条件）,1、GA产生菌具备以下条件（内在的调控因素）,琥珀酸辅酶A,GA产生菌体内有乙醛酸循环（DCA）的关键酶,通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA发酵积累,异柠檬酸裂解酶,3/2Glucose EMP 丙酮酸+丙酮酸+丙酮酸,乙酰辅酶A+乙酰辅酶A+乙酰辅酶A,柠檬酸,则有：3/2 C6H12O6+NH4+=C5H9O4N+4 CO2 产率：147/（180*3/2）=54.4%,CO2,谷氨酸,在前述GA 合成所必需的条件的基础上，体系不存在CO2固定反应，则有：,体系存在CO2的固定反应-对比说明,结论,通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%,在谷氨酸发酵中，DCA环可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充,.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：,Glucose 丙酮酸+丙酮酸,CO2,则有：C6H12O6+NH4+=C5H9O4 N+CO2（来自何方）产率：147/180=81.7%,乙酰辅酶A+C4二羧酸,CO2,草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）,苹果酸（苹果酸激酶）,柠檬酸（DCA循环封闭）,谷氨酸,EMP,四碳二羧酸的来源-总结,在生产菌中检出CO2固定反应酶活性,磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到81.7%,C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O,需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：,氨的导入,合成谷氨酸的反应有3种：,2、影响谷氨酸合成的外在因素（外在调控因素）,生物素供氧浓度NH4+浓度磷酸盐含量,a、生物素对糖代谢的影响,生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用）,乳酸积累,碳源利用率降低，发酵液的pH值下降。,而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变,丙酮酸积累,（1）生物素对GA发酵的影响,控制生物素？,主要影响糖降解速度，不影响EMP与HMP途径的比率。生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，引起乳酸的溢出。,b、控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭,丙酮酸的有氧氧化就会减弱？则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。,当VH缺乏时：,c、生物素对氮代谢的影响,VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象,GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。,结论,氨的导入时,生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度,防止,控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。,关于氮代谢的调节：,d、VH对菌体细胞膜通透性的影响,通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现对菌体细胞膜通透性的调节。,谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养基中积累。,Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适 量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使Glu得以积累。,生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培 养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不 积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,细胞透性的调节方法：细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等），达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。,细菌细胞Glu排出控制机制,生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜甘油：甘油缺陷型菌株丧失-磷酸甘油脱氢酶，不能合成-磷酸甘油和磷脂。限量供应，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性、,B、供氧浓度,过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,C、NH4+浓度,影响到发酵液的pH值.与产物的形成有关：过低，不利于-KGA的还原氨基化；过高，产生谷氨酰胺。NH4+的供给方式：液氨流加尿素,D、磷酸盐,促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等,可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出,产生并积累Val,过量：,研究证明：,谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径有关 的酶,TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关,以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4 二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷 氨酸生成期此循环应关闭,谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果 酸酶，与谷氨酸得率正相关,57,丧失或有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化；CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环；谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；有过量的NH4+存在，-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外；同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。生产菌株还应该具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特点。,二、谷氨酸高产菌模型特征,第五节 谷氨酸的生产工艺,我国与国外谷氨酸生产的现状及存在问题菌种的性能：我国产酸8.610，转化率55；日本1012，转化率55。工艺和过程控制：我国低糖和中糖发酵，日本高糖发酵并流加、提高罐压，保证溶氧。对温度、压力、空气流量、蛋白质、溶氧采用计算机控制。,一、谷氨酸生产菌及其特征,（一）谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质,现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.棒状杆菌属(Corynebacterium)：谷氨酸棒杆核菌Cornebateium gho-tamlkns）2.短杆菌属(Brevibacterium)：黄色短杆菌（Bteuibaterun flavum）、乳糖发酵短杆菌（Bra.lactofementum）3.小杆菌属(Microbacterium)：嗜氨小杆菌（Micrbaterium ammoniaphilmn）4.节杆菌属(Arthrobacterium),表1 谷氨酸发酵微生物特征及菌学比较,细胞形态为球形、棒形以至短杆形。革兰氏染色阳性，无芽孢、无鞭毛、不运动都是需氧微生物，在通气条件下才能产生谷氨酸。都是生物素缺陷型，需要生物素作为生长因子脲酶强阳性不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶发酵中菌体发生明显形态变化和细胞渗透性的变化CO2固定反应酶系活力强，异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱、乙醛酸循环弱，-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱；柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强，还原性辅酶进入呼吸链具有向环境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，能耐受高浓度的谷氨酸，产量在5以上。,（二）谷氨酸生产菌形态与生理的共同特征,（三）国内谷氨酸生产菌及其比较,1、北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征2、钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征 3、天津短杆菌(T6-13)的形态和生理特征 4、北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较 5、天津短杆菌(T6-13)与钝齿杆菌(B9)的比较 6、目前味精行业采用的主要菌株 S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学,二、谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,1、种子的菌体形态 斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下，细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小，一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分枝；细胞排列呈单个、成对及“V”字形，有栅状或不规则聚块；分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足，繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看，大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态.,2、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态,谷氨酸发酵过程中菌体形态变化及代谢特征,发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少，细胞不规则，发圆、发胖,缺乏“”字形排列，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞，类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片。,3、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态,三、菌种的扩大培养和种子的质量要求,1.种子培养过程,菌种：钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培养基，32培养18-24h。一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml三角瓶装量200250ml，震荡，32，培养12h。二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵灌投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32进行通气搅拌710h。,2、种子质量要求,一级种子质量标准：一级种子为摇瓶种子。质量要求：显微镜检查，无杂菌，菌体粗壮、均匀、排列整齐 涂平板检查无杂菌、无噬菌斑OD值净增0.6左右。种子营养液pH在6.7左右种子营养液残糖在0.5%以下。,平板检查无杂菌、无噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数108109/ml。pH在7.2左右，残糖含量在1.5左右。其它各项指标与一级种子相同。种龄和种量的控制一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。种量为1。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。,二级种子质量标准：二级种子为生产车间的种子罐中培养的，质量要求,四、谷氨酸的生产工艺,（一）谷氨酸发酵工艺流程,（二）原料的预处理,1.淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解酸水解法调浆：干淀粉用水调成10-110Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70及酸性条件下搅拌后过滤。,酶法：以大米或碎米为原料时采用调浆配料：大米进行浸泡磨浆，将淀粉乳调成1520B，用Na2CO3调pH6.4-6.5，用CaCl2调节浆中的Ca2+至50mg/L。加细菌a-淀粉酶（1012u/g，干淀粉计算)。喷射液化：一次喷射温度100105，层流罐维持95100，液化时间1h。典色反应棕红色。液化液经二次喷射，维持温度130140，灭酶510min，再经板式换热器冷却至70以下，进入糖化罐。糖化：糖化温度60 1，pH4.0-4.4；糖化酶（100120u/g，干淀粉计算)糖化过滤：糖液先用Na2CO3水溶液调pH4.8-5.0，过滤。,糖化液的质量要求色泽 淡黄色透明液糊精反应 无还原糖含量 2528DE值 9598透光率 60pH 4.6-5.0淀粉转化率 9598,糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。,（三）谷氨酸发酵控制,发酵培养基,1、碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖低中糖发酵：初始糖浓度12.5-13%.中高糖发酵：初始糖浓度14-16%。补糖发酵：初始糖浓度12-13%，中后期补糖2-4。目前，较多采用低糖浓度流加发酵控制。碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。,2、氮源：无机氮源:(1)尿素(2)液氨(3)碳酸氢铵；有机氮源:玉米浆、麸皮水 解液、豆饼水解液和糖蜜等。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌，分批流加。氨水用pH自动控制连续流加 C:N，谷氨酸发酵所需比为100：1521,3、无机盐：磷酸盐、硫酸镁、钾盐、微量元素磷酸盐：对发酵有显著影响，不足时糖代谢受抑制。控制在0.005-0.01mol/L硫酸镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。G要求镁离子浓度最低25ug/L；G-要求4-6 ug/L。钾盐：钾盐多，有利于产酸；钾盐少，有利于菌体生长微量元素：主要是锰（许多酶的激活剂）、铁（细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶活性基团组分，可促进谷氨酸产生菌的生长），10-610-4mol/L。严格控制铜、汞含量，以免对发酵产生毒害作用。,4、生长因子：参与细胞膜的代谢，影响膜的透性。(1)生物素（25ug/ml）(2)维生素B1生物素：乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，影响磷酯的合成。当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。当生物素缺乏时，菌种生长缓慢。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。,表 不同生产菌谷氨酸发酵培养基配方,（四）谷氨酸发酵工艺控制,1、温度对谷氨酸发酵的影响,微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围。谷氨酸产生菌的最适生长温度为3032，产生谷氨酸的最适为3437。菌体生长期温度过高,易造成菌体衰老。生产上表现为OD值增长慢，pH值高，耗糖慢，发酵周期长，谷氨酸生成少。在发酵中、后期，菌体生长基本停止，适当提高温度可促进产生谷氨酸。因此根据菌种特点，温度采用二级或三级管理。即发酵前期控制在30-32；中、后期34-37。,表42 菌谷氨酸产生菌的培养温度,2、pH对氨基酸发酵的影响及其控制,控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。,3、供氧对谷氨酸发酵的影响,溶解氧的控制：大小是由通风与搅拌两方面决定的，与搅拌器的型式、直径大小、搅拌转速、搅拌器在发酵罐内的相对位置因素等有关。一般搅拌器直径大，转速快，溶氧系数大。所以，增大搅拌转速比增加通风量对溶氧系数提高更为显著。,具体操作：发酵前期，以低通风量为宜；发酵中、后期，以高通风量为好。当培养基浓度高、营养丰富、生物素用量大时，应采用高通风量。当菌体生长缓慢、pH偏高时，应减少通风量，或停止搅拌，以利于长菌。当菌体生长快、耗糖快时，应提高通风量，以抑制生长和满足合成谷氨酸所必须的足够能量。,具体风量：前期1:0.12（V/V)；中期1:0.22-0.26；后期1:0.15-0.18,发酵通风量的控制,4、泡沫的消除,（1）泡沫的形成和性质搅拌与通风发酵液中含有蛋白胨、玉米浆、黄豆粉是主要的发泡剂。发酵液感染杂菌和噬菌体（2）泡沫对发酵的影响发酵灌的装料系数减少氧传递系数减少发酵液逃液，增加染菌机会,（3）泡沫的消除（控制）调整培养基的成分（少加或缓加宜起泡的原材料）；改变某些物理化学参数（pH、温度、通气和搅拌；改变发酵工艺）采用机械消泡或消泡剂消泡机械消泡：利用机械振动或压力变化使泡沫破裂消泡剂：属表面活性剂，天然油脂（豆油、玉米油）；脂肪酸和酯类；聚醚类（氧化丙烯和氧化乙烯与甘油的聚合物）；硅酮类,5、发酵过程主要变化及中间代谢控制,1.适应期 2.对数生长期 3.转化期 4.产酸期,谷氨酸的发酵过程曲线,（1）适应期：尿素分解出氨使pH上升，糖不利用，2-4h。措施：接种量和发酵条件控制使适应期缩短。（2）对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用后pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，维持温度30-32（3）菌体生长停止期：谷氨酸合成。措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37。（4）发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。,6、异常发酵现象及其处理,常见的异常发酵现象及其处理方法,7、发展方向,改进发酵工艺1.一次高浓度糖发酵2.降低发酵初糖浓度,连续流加糖发酵3.混合碳源发酵4.应用电子计算机控制和管理发酵,使发酵工艺最佳化5.固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸,（三）谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治,谷氨酸发酵过程中，若菌体受到噬菌体的侵染，一般会发生溶菌、发酵迟缓或停止等现象，结果造成不再积累谷氨酸，严重的会引起倒罐，甚至连续倒罐。为防止噬菌体的侵染，首先要了解谷氨酸噬菌体的特性，从而加以防治，确保谷氨酸发酵顺利进行。,噬菌体对发酵的危害,具有非常专一的寄生性。不耐热性(在70C，5min均死亡)。pH的稳定性：pH79时，稳定；低于6或高于10时，失活；小于4时完全失活。嗜氧性：在低溶氧情况下，抑制生长。对干燥的稳定性：环境越干燥，噬菌体越不易死。在潮湿情况下，易死亡。不耐药性。在甲醛05、苯酚05、漂白粉15、石灰水1下均可杀死噬菌体。,1.谷氨酸噬菌体的主要特征,发酵液光密度在初期开始上升，而后又下降或不上升。发酵液pH逐渐上升，48h内可达80以上，且不下降，不耗糖或耗糖缓慢。泡沫大、黏度大、有时呈胶状；可拔丝。发酵周期长，产酸低或不产酸。镜检时，菌体减少，缺少八字排列，菌体变胖，革兰氏染色呈红色片状。严重时呈网状或鱼翅状，几乎看不到完整细胞发酵中后期，周期稍有延长，温度缓慢上升，谷氨酸产量有所提高(菌体破裂释放出谷氨酸)。平板检查时，有噬菌斑。摇瓶发酵，发酵液稀而清。发酵液残糖高、颜色浑、发灰、发红、有刺激性臭味，黏度大，泡沫多，难中和，过滤困难。,2.谷氨酸发酵污染噬菌体后的异常现象,（1）严格控制活菌体的排放 摇瓶液、取样液、废弃菌液或发酵液均应先灭菌，后排放。已经污染了噬菌体的发酵液或种子液应先灭菌(80，5min)，再进行提取或排放。提取的母液不能乱扔，应经密闭阴沟或远离空压机房和发酵车间，才可排放。必须建立工厂环境清洁卫生制度，要定期使用药剂冲刷地面。,3.防治噬菌体污染的主要措施,（2）严防噬菌体进入种子罐或发酵罐 种子室要远离发酵车间，严防种子带入噬菌体，制定检查噬菌体的制度。各级种子的制备要严格灭菌。轮换使用菌种或使用抗噬菌体的菌株均可防止噬菌体污染。还可进行药物防治或选育抗链霉素突变株。进行药物防治可添加金属螯合剂(抑制噬菌体的吸附或DNA的注入)、表面活性剂(作用于细菌表面，抑制噬菌体的吸附)、抗生素(抑制噬菌体蛋白质合成)等。,谷氨酸发酵前期感染了噬菌体后，可以采用一系列抢救措施，以减少损失。(1)、抗性菌法：发现噬菌体后，应停止搅拌，小通风，降低pH，立即培养抗性种子，然后接人发酵液中；并补加13的不调pH的玉米浆。,4发酵罐中污染噬菌体后的抢救,(2)轮换菌种法：发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH，轮换使用菌种，如672换Asl.299、Asl.299换Asl.542、Asl.542换Asl.299。不加初尿，并补充3040玉米浆(不调pH)，适当加磷、镁(为正常量的13)。若pH仍偏高，可停止搅拌，适当通风，至pH正常，OD值增长后再开始搅拌。,(3)、灭噬菌体法。发现污染噬菌体后，停搅拌，小通风，降低pH，在罐内用夹层(或冷却管)加热至7080，并自顶盖通入蒸汽自排汽口排出，冷却后，若pH过高，停止搅拌，小通风，降低pH，接入二倍量的原菌种，至pH正常后开始搅拌。,(4)、放罐重消毒。发现噬菌体后，放罐，调pH，补加12的玉米浆和13的水解糖，重新灭菌，适当降低温度，不加初料，然后接入2%的种子，继续发酵。,谷氨酸发酵要求纯种培养，若遭受了杂菌的污染，轻者影响产量或质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。因此，在谷氨酸发酵中，杂菌污染的检查与防治是十分重要的。1、检查杂菌的方法 所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了阻碍生产的其他微生物。检查杂菌的方法要求准确、快速、尽早发现、及时采取措施。,（四）、谷氨酸发酵中杂菌的污染与防治,a.显微镜检查 用革兰氏染色法染色、镜检。若发现有芽孢菌、革兰氏阴性菌、长杆菌、球菌、菌体碎片等情况，说明发酵液已经染菌，应及时采取措施。,b.培养皿画线检查 平板检查时，先将灭菌后的培养基倒人培养皿内，冷却，接种，于37下培养24h，镜检。,c.肉汤培养检查法 此法主要用于检查空气系统及培养基是否带菌。具体做法是将培养液装在吸气瓶中，灭菌30min，在37 下培养24h，如无混浊，说明无杂菌污染；如呈现混浊，说明染菌。,要防止杂菌污染，先要弄清楚造成染菌的原因，然后进行防治。（1）杂菌污染的主要原因分析 种子带菌。若发酵前期染菌，可能是种子带菌所致或发酵罐本身染菌所致。为了避免种子染菌，在斜面种子、摇瓶种子制备过程中都必须严格操作，确保无杂菌污染。,罐体与管件渗漏所引起的染菌。若罐体或管件有极其微小的漏孔时，易引起染菌。有时漏孔用肉眼直接察觉不到，需要通过一定的试漏方法才能发现。,2、杂菌污染的防治,空气系统染菌。好气性发酵需连续不断地通人大量无菌空气。空气系统所有的设备要定时打开排液阀排液，避免设备内积液太多，带入空气中去，造成染菌。,环境污秽造成染菌。车间、环境卫生差，易引起染菌。为堵绝杂菌的来源和繁殖机会，必须加强车间和环境的清洁卫生工作。,死角。罐或管路连接处的死角，在灭菌时其中的杂菌不易被杀死，易造成连续染菌，影响生产。,3、杂菌污染的防治与挽救 污染了杂菌后，要根据具体情况，及时采取措施加以挽救。具体措施为：(1)一级种子经平板检查确认无菌后，方可接入二级种子中。(2)二级种子冷却，小于10保压1216h，平板检验确认无杂菌后，再接入发酵罐。(3)发酵0-6h后，大幅度染菌，镜检发现球菌，应放罐重消毒，消毒温度适当降低。,(4)发酵12h后，发现污染有少量芽孢或杆菌，但光密度尚正常，pH仍有升降，耗糖一般，谷氨酸产量在0.2以上，则可加大通风量，按常规发酵到底。(5)发酵后期确认染球菌，则可加热至7080放罐。(6)发现染菌的罐，下次空罐消毒加入甲醛后，再用蒸汽熏蒸0.12-0.17Lm3。(7)加强车间卫生管理，防止活菌体飞扬。(8)选用抗药性菌种。,第八节 谷氨酸的提取,一、概 述,将谷氨酸生产菌在发酵液中积累的L-谷氨酸提取出来，再进一步中和、除铁、脱色、加工精制成谷氨酸单钠盐叫提炼。谷氨酸是发酵的目的物，它溶解在发酵液中，发酵液的特点：温度34-36；pH6.5-7.5；外观浅黄色浆状，表面浮有少许泡沫。存在菌体、残糖、色素、胶体物质以及其他发酵副产物。提取工艺的选择原则：工艺简单，操作方便，提取收率高，产品纯度高，劳动强度小，设备简单，造价低，使用的原材料、药品价廉，来源容易。,主要提取方法简介,(1)等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。(2)离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。(3)等电-离交法(4)连续等电点法(5)金属盐法(6)盐酸水解-等电点法(7)离子交换膜电渗析法提取谷氨酸,二、等电点法提取谷氨酸,1.等电点法提取谷氨酸的原理谷氨酸发酵液不经除菌或除菌、不经浓缩或浓缩处理、在常温或低温下加盐酸调至谷氨酸的等电点pH3.22,使谷氨酸呈过饱和状态结晶析出。,2、等电点工艺的类型（1）直接常温等电点法（2）带菌体冷冻低温一次等电法（3）除菌体常温等电点法（4）浓缩、水解等电点法（5）低温浓缩等电点法（6）谷氨酸发酵液连续等电工艺,3.pH值对谷氨酸溶解度的影响pH 为3.22时,大部分谷氨酸以GA形式存在,此时谷氨酸的氨基和羧基的离解程度相等,总静电荷为零。谷氨酸的溶解度随pH值的改变而改变,pH 3.22和在30%以上的高浓度盐酸下,溶解度便显著减少到最低点。4.温度对谷氨酸溶解度的影响 温度对谷氨酸溶解度的影响 谷氨酸溶解度受温度的影响较大,温度越低,溶解度越小。,（1）谷氨酸的晶型及性质：型（颗粒大）、型（细小，针状）,5、谷氨酸的结晶,晶型呈、两种，型结晶是大型结晶，在纯谷氨酸溶液中为斜方六面体晶，纯度高，颗粒大，质量重，易沉降，与母浓分离容易，是一种理想的结晶。而 型结晶，晶粒微细，纯度低，质量轻，难沉降不易沉淀析出。,（2）影响谷氨酸结晶的主要因素 Glu含量要求：4 温度：低于30。30，型结晶增加。残糖浓度：低有利于型结晶增加 中和时加酸的速度：缓慢使谷氨酸溶解度逐渐降低，可控制一定数量的晶核，使晶核形成少，经养晶育晶后成长壮大。因而，析出的结晶颗粒大，易于沉淀分离。加晶种：Glu含量5左右，在pH4.0-4.5投晶种；Glu含量3.5-4.0左右，在pH3.5-4.0投晶种；搅拌：自然起晶，结晶大小不匀；缓慢冷却，适当搅拌，有利于晶体长大，大小均匀一致。,三等电点法提取谷氨酸 工艺流程,（一）直接常温等电点法工艺流程,去菌体低温等电点法提取谷氨酸 工艺流程,1.加酸调等电点 将发酵液排入等电桶后，测量温度、pH和谷氨酸含量，然后搅拌冷却，待液温降至30时，加盐酸调pH。前期加酸稍快，1h左右将发酵液的pH调至5.0。中期加酸要缓慢，约经2h，发酵液的pH接近4.0-4.5时，观察晶核形成情况。当能目视发现晶核时，要停止加酸，育晶12h，使晶核壮大。此后加酸速度要慢，直到pH为3.0-3.2时，停止加酸，继续搅拌20h结束。整个