第三章_基因工程制药.ppt.ppt

第三章 基因工程制药 一、基因工程药物 二、基因工程制药基本技术 三、基因工程制药实例,作业 查阅资料，介绍某种基因工程药物的生产工艺。,一、基因工程药物,1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国Eli Lilly公司问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。,基因工程技术可生产的药物和制剂包括：（1）免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；（3）激素：如胰岛素、生长激素、心素纳；（4）酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。,主要基因工程产品的研制、开发、上市时间,美国已批准了56种生物制剂部分摘录（1）,产品 公司 主要适应症-人胰岛素Eil Lilly 糖尿病人生长激素 Eil Lilly 儿童生长激素缺乏症&2a干扰素 Hoffmann-La Rocke 白血病a-2b干扰素 Schering-Plough 白血病、爱滋病、肝炎小鼠抗CO3单抗Ortho Biotech 肾、心移植排斥反应乙肝疫苗MSDMerck 乙型肝炎t-pA（altepl-ase）Genentech 急性心肌梗死、肺栓塞B型嗜血性流感疫苗 Praxis Biologics B型嗜血性流感,美国已批准了56种生物制剂部分摘录（2）,产品 公司 主要适应症-EPO Ortho Biotech慢性肾衰竭贫血a-n3干扰素Interferon Sciences 性疣r-1b干扰素Genentech 类风湿rG-CSFAmgen 化疗所致的白细胞减少GM-CSFImmunex 自体骨髓移植白细胞介素-2Chiron 转移性肾癌凝血因子VII Genetics Institute 血友病,美国已批准了56种生物制剂部分摘录（3）,产品 公司 主要适应症-1b干扰素 Berlex Lab Chiron 多发性硬皮病-葡萄糖苷脂酸Genzyme Gaucher遗传病单抗治疗剂 Centocor 抗血液凝固因子VIIINovo 血友病HumalogLilly 糖尿病Nateplase三井-持田 溶血栓alfacon-1干扰素Amgen 慢性丙肝干扰素8-nlOtsuka（日本）治疗蕈样真菌病,1989年，我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物重组人干扰素lb，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素lb是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物，也是我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。截至2001年底，一共批准了21种基因工程药物和疫苗，其中3种是拥有自主知识产权的一类新药，即 a-1b干扰素、重组牛碱性成纤维细胞生长因子和重组链激酶。世界上销售额排名居前10位的基因工程药物和疫苗，中国已能生产6种。,我国2001年前批准的基因工程药物,2006年4月前我国批准上市的35种生物技术药物,我国目前能够生产的生物制剂（1）,（1）干扰素a-1b（2）干扰素a-2a（3）干扰素a-2b（4）r干扰素（5）白介素-2（6）粒细胞集落刺激生长因子G-CSF（7）粒细胞-巨噬细胞集落刺激生长因子GM-CSF,我国目前能够生产的生物制剂（2）,（8）链激酶（9）促红细胞生成素EPO（10）碱性成纤维细胞生长因子bFGF（11）人生长激素GH（12）人胰岛素（13）乙肝疫苗（14）痢疾疫苗进入I期、II期临床：t-PA（组织纤溶酶原激活剂），白细胞介素-3，重组人胰岛素，尿激酶等,我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。,囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。,胰岛素,1000 磅牛胰 10 克胰岛素,200 升发酵液 10 克胰岛素,干扰素,1200 升人血 1 升发酵液,23 万美元/病人 200300 美元/病人,基因工程（genetic engineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。,供体细胞,载体分子,外源DNA,外源基因,分离,酶切,酶切,连接,转化扩增,DNA重组分子,受体细胞,鉴定与表达,重组转化子,工程菌或细胞蛋白产物,工程菌或细胞培养,重组产物分离纯化,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,基因工程的操作流程,1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体细胞5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物,基因工程制药的基本过程,获得目的基因构建重组质粒组建基因工程细胞工程菌培养产物分离纯化,目的基因的获得,一、酶切法直接分离目的基因二、PCR直接扩增目的基因三、文库法分离目的基因四、化学合成目的基因,酶切法直接分离目的基因,gagctc,aagctt,限制性内切酶在DNA克隆中的应用,PCR,Polymerase chain reaction聚合酶链式反应,PCR的基本原理,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,55,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,片段化、分级分离,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,化学合成目的基因,什么是载体？,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,载体概述,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,载体概述,三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因Lac Z，可利用-互补原理进行蓝白斑筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。,质粒载体,连接,转化受体细胞,1、抗药性检测筛选法,2、显色检测,IPTG：异丙基硫代半乳糖苷 诱导物X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷,3、限制酶切图谱检测,4、PCR扩增检测,用PCR的方法检测是否插入外源基因片段。优点：不需要合适的酶切位点。缺点：假阳性高。,5、原位杂交检测,根据插入DNA片段的序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据,6、序列测定双脱氧测序,双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,双脱氧末端终止测序法,Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,测序读片,近年来，建立了一种使用荧光染料的无放射性标记的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基的目的。激光检测器把收集到的信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基顺序。这样一个泳道一次电泳可读出450左右个碱基，一块凝胶36个泳道可测36450约16200个碱基，大大加快了测序的速度。后来又发明了一种用毛细管电泳代替凝胶电泳的方法，可大大加快电泳的速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。,测序结果,7、外源蛋白质检测,利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质，检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体的检测。,受体细胞选择,外源基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌细胞中的表达外源基因在病毒中的表达外源基因在酵母细胞中的表达外源基因在昆虫细胞中的表达外源基因在植物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达,1、大肠杆菌表达系统大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。,2、枯草杆菌表达系统枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。,在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。,包涵体表达,融合型表达,将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达,由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。,N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,常用的受体蛋白（原核细菌表达的蛋白质）,（D3）受体蛋白的切除方法,化学断裂法：溴化氰（CNBr）-Met-（切点）-AA酶促断裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序列:IleGluGlyArg-（切点）-AA,分泌表达蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,分泌蛋白表达的原理图示,常用的大肠杆菌信号肽,碱性磷酸酶信号肽（phoA）膜外周质蛋白质信号肽（OmpA）霍乱弧菌毒素B亚单位（CTXB）。,酵母表达系统,能提高重组异源蛋白产率的诱变酵母菌,基因工程细胞的扩大培养,（一）基因工程菌的稳定性（二）基因工程菌培养的程序（三）基因工程菌的培养方式（四）影响基因工程菌培养的各种因素分析（五）基因工程菌的培养设备-生物反应器,1、基因工程菌质粒的不稳定性,基因工程菌质粒不稳定与2个因素有关：（1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的改变。由于丢失质粒的细菌要比含有质粒的工程菌更具有生长优质，因此在竞争中最后会取代工程菌，而演变成为优势菌。最后导致蛋白质表达量的减少。,2、质粒稳定性的分析方法,（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。,3、质粒不稳定的原因,1、分裂不稳定-是指基因工程菌在分裂的子代菌体中，出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关：（1）工程菌产生丢失质粒的概率，拷贝量低的工程细菌，它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。（2）丢失质粒的细菌、含有质粒的工程菌之间的竞争力大小。2、结构不稳定-是指外源基因从质粒上丢失、或者发生碱基后果排、缺失现象，最终导致工程菌性能改变的现象。,4、提高质粒稳定性的方法,（1）、分阶段培养法（2）、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施,（1）、分阶段培养法,工程菌的培养一般分为2个阶段：（1）第一阶段-先使菌体生长至一定密度。（2）第二阶段-开始诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了工程菌的稳定性。,（2）、培养基中加入抗生素，形成选择性压力,因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。所以可以通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。,（3）、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施,通过以下方法可以提高质粒的稳定性。（1）间歇送氧（2）改变稀释速率,（二）基因工程菌培养的程序,1、摇瓶操作-通过摇瓶操作，来子解工程菌生长的基础条件，如温度值、培养基的组分、氮碳比、表达产物的积累对于工程细胞的影响。2、培养罐操作-通过培养罐操作，来确定培养参数、确定培养方案、以及确定培养顺序。,（三）基因工程菌的培养方式,1、补料分批培养2、连续培养3、透析培养4、固定化培养5、高密度培养,1、补料分批培养,是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。其目的是为了创造一个良好的微生物环境，延长菌体的对数生长期，来获得高密度的菌体总量。,2、连续培养,将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养达到一定的菌体浓度之后，同时进行进料、出料的操作，通过控制一定的营养物稀释比率，来进行不间断式培养的方式，称为连续培养。连续培养有利于保持生产环境的恒定，有利于控制菌体的生长速率。但是由于基因工程菌的不稳定性，导致连续培养比较困难。,3、透析培养,透析培养是利用膜的半透性原理，使得代谢产物和培养基分开，通过去除培养液中的借调产物的方法来消除代谢产物对工程菌的不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成二半，形成发酵液区、和透析液区，通过透析来及时移去合成产物。半透膜的种类、孔径、面积、发酵液和透析液的比例、透析液的组成、循环流速、培养持续时间等等因素会影响产物的得率。用透析法培养大肠杆菌E.coliHB101（pPKAS2）生产青霉素酰化霉，其产率可以提高11倍。,4、固定化培养,为了维持质粒的稳定性，人们将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。,高密度培养技术,又称高密度发酵技术，指提高基因工程菌菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率，即单位体积单位时间内产物的产量。优点：不仅可以减少培养体积、强化下游分离提纯，而且可以缩短生产周期，减少设备投资，从而降低生产成本。,大肠杆菌高密度培养技术,大肠杆菌高密度发酵理论最大值为400g DCW/L（DCW：dry cell weight），相对于发酵液中25%是大肠杆菌细胞。迄今为止，最高密度发酵的两个例子是非重组菌E.coli W3110（密度为174 g DCW/L）；生产聚-3-羟基丁酸的重组菌（密度为175.4 g DCW/L）,影响大肠杆菌高密度发酵的因素,发酵培养基：碳氮比；碳源氮源浓度表达基因的调控宿主菌质粒拷贝数和稳定性诱导时间和诱导强度,大肠杆菌高密度发酵的补料调控：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料,乙酸对生长和表达的影响：减少乙酸,酵母菌高密度培养技术,大肠杆菌高密度发酵理论最大值为280g DCW/L（DCW：dry cell weight），目前发酵过程中，一般认为酵母密度为100200 g DCW/L即为高密度发酵。常用高密度发酵宿主菌是巴氏毕赤酵母,毕赤酵母高密度培养技术,首先用含甘油的合成培养基培养，外源基因的表达被完全抑制。当甘油消耗完，开始流加甘油至培养物种，使细胞限速生长。最后流加甲醇或甲醇与甘油混合物，诱导外源基因表达，同时检测培养液中的外源蛋白浓度，到适当水平停止发酵和收获目的蛋白。,实例：表达重组人血清白蛋白（rHSA）毕赤酵母工程菌高密度培养,在15L多参数全自动发酵罐中，OD600达500700，密度达115160g DCW/L，rHSA蛋白表达量达3.6g/L。工艺：22h分批发酵结束后，开始流加补料发酵培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在46h达到OD值700，达到高密度，停止流加。当DO陡然上升到70%，开始流加诱导表达培养基，通过控制流加速率，以控制溶氧浓度（DO）在20%以上。在120h，rHSA表达量最大达到3.6g/L。,（四）影响基因工程菌培养的各种因素分析,基因工程菌传统微生物生物材料含外源重组基因 不含外源重组基因发酵工艺使外源基因高效表达 使自身基因表达目的产生外源蛋白质 产生自身的代谢产物1、培养基的影响2、接种量的影响3、温度的影响4、溶解氧的影响5、诱导时机的影响6、PH值的影响,1、培养基的影响,（1）常用的碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、制定水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。（3）其它组成成份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。（4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。,2、接种量的影响,接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。（1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。（2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。（3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。,3、温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。（1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。（2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。（3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。（4）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。举如说明如下,温度影响的例子,（1）大肠杆菌合成青霉素酰化酶，从37起随着温度的下降，青霉素酰化酶的合成产量逐渐增加，20-22时达到高峰，16以下，青霉素酰化酶的产量反而下降。这是由于在18-16时，工程菌生长减慢。实验证明，造成这种减慢的原因是由于温度影响了细胞内青霉素酰化酶mRNA的浓度。（2）分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF，在 30时，蛋白质表达量最高，37时，由于细菌的热休克系统被激活，其蛋白质表达量反而下降。（3）重组人生长激素工程菌，在30时的产物是可溶的，而在37所表达出的蛋白质则是不溶的。,4、溶解氧的影响,溶解氧对于工程菌发酵过程中的菌体代谢是具有十分重要的作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气的生化反应过程。因此，维持较高水平的溶解氧水平（DO240%），才能维持工程菌的快速生长和繁衍。分泌型人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coliW3100/pGM-CSF的发酵过程中，如果溶解氧20%，则产生大量杂蛋白。影响以后的纯化。必须维持溶解氧25%的水平。采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,5、诱导时机的影响,对于PLclts875突变株工程菌来说，在28-30培养时，这时突变体能产生阻遏蛋白、来阻止启动子的转译。而当温度上升到42时，这种阻遏作用就消失。在这里，温度对于工程菌的表达起着诱导作用。一般来说，对于处在生长期后期的工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，通过升温诱导，可以达到蛋白质表达增产的效果。这在工业化生产中具有较大的潜力。,6、PH值的影响,PH对于细胞的正常生长、外源蛋白的高效表达都有影响。（1）细胞生长期的最佳PH范围是6.8-7.4。（2）外源蛋白表达的最佳PH范围是6.0-6.5。在发酵过程中，细菌自身对PH值具有一定的调节能力。当PH值超出其调节能力的范围时，就会影响细菌的生长。发酵前期，PH值可控制在7.0，随着蛋白质的表达，PH值不断下降，当PH6.0时，则应及时开动碱泵，加入碱液。,（五）基因工程菌的培养设备-生物反应器,基因工程药物的分离纯化技术,（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点（二）分离纯化技术的重要性（三）分离纯化的基本步骤和方法,（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点,1、目的产物在初始物料中含量很低。2、初始产物的组成十分复杂。除了目的蛋白质之外，还含有残余细胞、代谢产物、残余培养基、各种无机盐。3、目的蛋白质的稳定性很差，容易失活、变性，对于温度、PH、金属离子、有机溶剂十分敏感和脆弱。4、目的蛋白质的种类繁多，存在着大小不同的片段。5、纯度不高、常常含有杂菌、热原等等物质。,（二）分离纯化技术的重要性,为了获得高纯度、可供药用有生物活性蛋白质，必须对基因工程药物进行一定的分离和纯化。1、分离-以大肠杆菌为宿主的基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类产物时，需要经过细胞收集、细胞破碎、细胞碎片分离的过程。2、纯化-经过破碎和分离之后，目的产物仍然存在着大量的杂质，杂蛋白质、类似蛋白质的异构体，为了获得合格的目的产物，必须进行纯化操作。3、精制-非蛋白质类纯质在经过纯化操作之后，仍然无法除去，需要进行灭菌和精制操作。,（三）分离纯化的基本方法,1、细胞收集-离心法。2、细胞破碎：（1）机械破碎法-高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法、（2）非机械破碎法-酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。3、固液分离-离心法、膜过滤法、双水相分配萃取法。4、纯化色谱技术-离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色彩谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱。5、除非蛋白质杂质技术-除DNA、除热原、除病毒。下面针对不同的技术作讲解-见第六章生物制药下游技术。,包涵体蛋白,收集菌体破碎细胞离心分离包含体洗涤包含体变性剂溶解包含体层析纯化目标蛋白复性,融合蛋白,根据表达部位，进行不同提取融合蛋白重折叠亲和层析裂解回收目的蛋白,分泌型蛋白,离心或过滤收集培养液沉淀或超滤吸附层析离子交换层析凝胶过滤亲和层析,胞内可溶性蛋白,离心收集菌体破碎细胞亲和层析,细胞周质表达蛋白,离心收集菌体低浓度溶菌酶处理渗透压法裂解如果形成沉淀，用尿素等变性剂溶解，然后透析复性,发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物浓缩初步纯化高度纯化产品细胞破碎固液分离 包含体 细胞碎片浓缩初步纯化高度纯化制剂产品变性除膜复性浓缩初步纯化高度纯化制剂产品,分离纯化的基本步骤,三、基因工程制药实例,第四节 基因工程制药的具体实例,（一）干扰素a-2b（二）乙肝疫苗（PP56）（三）人胰岛素（p105）（四）人生长激素（p109）（五）重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（p101）（六）促红细胞生成素（p107、pp59）（七）重组甲状腺旁素（pp51）（八）重组人白细胞介素-2,（一）干扰素a-2b,干扰素（INF）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等等作用,是人体防御系统的重要组成部分,干扰素（INF）最早被用于诱导人体产生白细胞。根据分子结构和抗原性的差异，将干扰素（INF）分为、四种类型。又根据氨基酸残基的结构不同将干扰素分为a-1b、a-2a、a-2b等亚型。1、基因工程菌的组建2、基因工程菌的发酵生产3、干扰素的制备4、质量控制标准和具体要求,1、基因工程菌的组建,人染色体上的干扰素基因只有1.5%，拷贝量极少，所以不能直接从人体的染色体上分离干扰素基因。,工程菌构建,诱生的白细胞或者成纤维细胞提取核酸 通过寡dT-纤维素柱提取mRNA pBR322质粒 5%-23%蔗糖密度梯度离心提取12S-mRNA PstI内切酶切割 由mRNA转录成cDNA 切割段位于内酰胺基酶基因内 结果导致内酰胺基酶失活，不抗青霉素双链cDNA用末端PstI酶切割 再用DNA转移酶接上dT或者dG 在pBR322质粒DNA的切割段加上dA或者dC+退火获得杂交质粒 转化大肠杆菌K-12扩增杂交质粒 筛选能够抗四环素、但是对氨苄青霉素敏感的细菌克隆株 采用杂交翻译法挑选含有干扰素cDNA的克隆 将干扰素cDNA克隆进表达载体 在大肠杆菌中进行高效表达（进入下游工艺）,2、基因工程菌的发酵生产,人干扰素a-2b的基因工程菌为SW-IFNa-2b/E.coliDH5a。质粒使用PL启动子，含有四环素抗性基因。种子培养液含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl 基因工程菌接种到4个1000ml三角烧瓶之中，每个烧瓶内装有250ml种子培养基，30摇床培养10小时，作为发酵罐的种子用15L发酵罐进行发酵，装发酵培养基10L发酵培养基组成如下（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/ml四环素、少量防泡沫剂，PH=6.8。）搅拌转速500r/min、通气量为1：1v/v*min、溶氧量为50%30发酵8小时（细菌增殖阶段）42诱导2-3小时（产物生产阶段）鉴控手段：每隔不同时间，取2毫升发酵液，10000r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。,3、干扰素的制备,发酵物质4000r/min离心30min，除去上清液，得湿菌，从其中取100g。悬浮于20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）500ml之中，冰浴条件下进行超声破碎。4000r/min离心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室温条件下，进行搅拌抽提2小时，提取液组成配方8mol/L尿素、20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）、0.5mmol/L二巯基苏糖醇。提取液15000r/min离心30min，下层不溶弃去。取上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）稀释至尿素浓度0.5mol/L加入0.1mmol/L二巯基苏糖醇，4搅拌15小时。15000r/min离心30min，除去不溶物。上清液用截流量=10000相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩浓缩液采用Sephadex G50层析柱分离，层析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）平衡固定相，上柱之后，用同一缓冲液洗脱分离收集人干扰素a-2b部分，用SDS-PAGE检查。再经DE-52柱进行纯化层析柱2cm*50cm、上柱之后，分别采用含有0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L的NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.0）洗涤。收集含有收集人干扰素a-2b部分。分装冻干成品鉴定成品包装。得率要求：全过程蛋白质回收率为20-25%，产品不含杂蛋白质、DNA、热原质检测合格。,4、质量控制标准和具体要求,（1）半成品检定（2）成品检定,（1）半成品检定-13项指标,1、干扰素效价测定-采用细胞病变抑制法，用Wish细胞、VSV病毒作为基本检测系统，对照国家标准、或者国标参考品。2、蛋白质含量测定-用福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白质作为对照3、比活性测定-干扰素效价国际单位蛋白质含量的毫克数4、纯度测定（1）银染显色法测定应为单一显色区带，（2）扫描仪测定纯度应在95%以上，（3）SDS-PAGE电泳测定允许少量聚合体存在，但不超过10%，（4）高效液相色谱测定应呈一个吸收峰状态，主峰应占峰总面积的95%，（5）GPC柱纯度测定也应呈一个吸收峰状态，主峰应占峰总面积的95%。,5、相对分子量测定-用还原型SDS-PAGE法，加样不低于5ug，用已知分子质量的蛋白质标准化系列作对照，迁移率为横坐标、相对分子质量的对数作为纵坐标，计算相对分子质量，其误差不得高于10%。6、残余外源性DNA含量测定-用放射性核素或生物素探针法测定，每一剂量中的残余外源性DNA应低于100pg。7、残余抗生素活性测定-凡是菌种传代中使用过抗生素的基因工程产物，必须进行残余抗生素活性测定，半成品中不得检出残余抗生素活性。8、紫外光谱扫描-用全自动扫描紫外分光光度计测定光谱图，其最大吸收值应为280nm2nm。9、肽图测定-用CNBr裂解法测定，每一批次之间应该保持一致。10、等电点测定-等电点聚焦电泳法，每一批次之间应该保持一致。11、无菌试验-微生物学检测法。12、热原质试验-鲎试剂法。,（2）成品检定-7项指标,1、物理性状-外观为折色、微黄色疏松体，加入注射用蒸馏水之后，不得含有肉眼可见的不溶物。2、鉴别试验-（1）ELISA试验、（2）中和试验3、水分测定-用卡氏水分测定仪，水分含量应低于3%。4、无菌试验-微生物学检测法。5、热原质试验-鲎试剂法。6、干扰素效价测定-采用细胞病变抑制法，用Wish细胞、VSV病毒作为基本检测系统，对照国家标准、或者国标参考品。效价不得低于标示量。7、安全试验-实验动物测定法：（1）取体重350-400g豚鼠3只，每只腹侧皮下注射人体临床允许最大量的3倍剂量，饲养观察7天，如果豚鼠局部无红肿、坏死，豚鼠总体重不下降，说明成品合格。（2）取体重18-20g小鼠5只，每只尾静脉注射人体临床允许最大量的3倍剂量，饲养观察7天，如果小鼠全部存活，说明成品合格。,干扰素生产车间,（二）应用实例-乙肝疫苗的生产,1、乙肝病毒：（1）二十面体核衣壳，2527nm。（2）具有包膜，直径3545nm。（3）主要结构蛋白为C蛋白，又称核心抗原（HBcAg）。（4）包膜表面的病毒蛋白，乙肝表面抗原（HBsAg）。,乙肝病毒表面抗原氨基酸序列,乙肝疫苗第一代乙肝疫苗，属血源疫苗，由无症状乙型肝炎表面抗原阳性者的血浆制备而得。因提取工艺不同，疫苗所含成分也有一定的差别，但均含有22 nm小颗粒乙型肝炎表面抗原。血源疫苗曾对防止乙肝流行发挥了重要作用，但是，疫苗的成本高、生产周期长(65周)，还存在传播艾滋病和肝炎的潜在危险。第二代乙肝疫苗，将编码乙型肝炎表面抗原的基因在哺乳动物细胞或酵母菌中高效表达，得到乙肝基因工程疫苗，接种者中约有10%不产生应答反应；另有5%15%接种者属低应答者，低应答者不能获得完全保护作用。,第三代乙肝疫苗，乙肝病毒包膜的抗原性主要由S抗原和前S1、前S2抗原组成组成，美国Medeva制药公司利用基因重组技术，在哺乳动物细胞成功地表达了包含S抗原和前S1、前S2抗原的第三代重组疫苗，1998年用于临床，能诱导更高的血清阳转率和抗体应答反应。新生婴儿，特别是母亲为乙型肝炎表面抗原阳性的新生婴儿，产后应立即给婴儿接种乙肝疫苗，学龄前和学龄儿童亦应接种。一般人群(包括新生婴儿)正常接种：上臂三角肌肌肉注射，全程注射三次，每次注射10g，第一次注射后隔三个月和六个月注射第二次和第三次。,2、表达载体构建,3、工艺流程,工程菌构建发酵细胞破碎超滤 工艺3排阻色谱离子交换色谱超离心脱盐无菌过滤Al(OH)3吸附分装,微滤硅胶吸附疏水色谱硫氰酸盐处理,表面活性剂提取沉淀、离心、超滤凝胶色谱离子交换色谱超滤,工艺2,工艺1,4、酵母重组乙肝疫苗的生物学活性评价,我国现行的是小蛋白疫苗，即S疫苗，其优点：S是HBsAg主要成分，其抗体有良好的中和作用。S蛋白具有分泌性，利于产物的纯化。S蛋白可形成颗粒，具有良好的免疫原性。缺点：510%的接种者弱反应或无反应。至少需3针以上的免疫接种。仅有预防作用而无治疗作用。,5、酵母重组乙肝疫苗质量标准,（三）基因工程生产人胰岛素,1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点。,基因工程人胰岛素生产工艺,（1）A链、B链分别表达法（2）人胰岛素原表达法（3）分泌型人胰岛素原表达法,质量控制,融合蛋白中人胰岛素原检测：非放射性标记法鉴别胰岛素：反相HPLC法；肽谱图法效价测定：反相HPLC法,研究热点,类胰岛素开发胰岛素分泌基因工程,