第4章发酵工业灭菌.ppt.ppt

,发酵工程,第一章 发酵工程总论第二章 发酵设备第三章 发酵工业原料及其处理第四章 发酵工业灭菌第五章 发酵菌种的制备第六章 发酵工业放大第七章 微生物发酵机制第八章 发酵动力学第九章 发酵过程工艺控制第十章 发酵染菌及防治第十一章 发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章 展望,在发酵工业生产中，杂菌污染是发酵生产失败的最主要因素之一。为了防止杂菌污染，在发酵进行前发酵设备和发酵培养基均需采用不同措施进行无菌处理。因此，发酵工业灭菌在整个发酵生产过程中显得尤为重要，灭菌彻底与否关系着发酵生产是否正常运行。,为此，本章将从灭菌方法、针对不同情况的灭菌措施和无菌空气制备讲述发酵工业灭菌。本节课主要讲授发酵工业灭菌方法和原理、发酵设备和发酵培养基的灭菌。,本节课的重点和难点,本节课的重点 1、发酵工业的灭菌方法 2、发酵培养基的灭菌方法 3、连续灭菌和批式灭菌,本节课的难点 1、各种常用灭菌方法的机理 2、连续灭菌时间的确定,1 灭菌方法及原理2 发酵培养基及设备的灭菌3 无菌空气的制备,第四章 发酵工业灭菌,1 灭菌方法及原理,第四章 发酵工业灭菌,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,1.1 化学灭菌1.2 辐谢灭菌1.3 干热灭菌1.4 湿热灭菌1.5 过滤灭菌,灭菌“sterilization”：采用物理或化学方法杀死或除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。,灭菌与消毒,消毒“disinfection”：采用物理或化学方法杀死容器、器具内外、车间、厂区等环境中的病原微生物，但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。例如巴氏灭菌法（60，30 min）。,实验室内哪些操作属于灭菌，哪些属于消毒呢？,化学灭菌：指用化学药品直接作用于微生物而将其杀 死的方法。,1.1 化学灭菌,适用范围：生产车间、无菌室、实验室、接种操作前 小型器具及手的消毒等。,使用方法：浸泡、添加、擦试、喷洒、气态熏蒸等。,化学灭菌的机理 一些化学物质与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、核酸的破坏、酶类失活、细胞膜透性的改变而杀灭微生物。,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,试举例几种常用化学消毒剂浓度及使用范围？,辐射灭菌：指利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。,1.2 辐射灭菌,适用范围：接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面。,注意事项：30 W紫外灯开启30 min即达到灭菌效果，一般与化学灭菌结合使用。,紫外线杀菌的机理 微生物细胞在紫外线照射下细胞中DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制；空气在紫外线照射下产生的臭氧（O3）也有一定的杀菌作用。,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,1.3 干热灭菌(dry heat sterilization),适用范围：玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品。,灼烧灭菌干热空气灭菌,干热条件：在160 条件下保温1.5 h。,干热灭菌的机理 在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高。,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,1.4 湿热灭菌(moist heat sterilization),http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,水煮常压灭菌(100,40-60 min)高压湿热灭菌(121,20-30 min),适用范围：培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。,湿热灭菌的机理 借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。在有水分存在的情况下，蛋白质更易受热而凝固变性。湿热灭菌的温度和时间需根据灭菌对象和要求来决定。,思考为什么湿热灭菌效果比干热灭菌效果好?,过滤除菌的方法 用0.010.45 m孔径滤膜对压缩空气、酶溶液、啤酒及其他不耐热化合物溶液除菌。,1.5 过滤灭菌,过滤除菌的原理 利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。,实验室内用过哪些过滤器呢？,2.1 发酵培养基的灭菌2.2 发酵设备的灭菌,2 发酵培养基与设备的灭菌,第四章 发酵工业灭菌,2.1.1 发酵培养基的灭菌方法,2.1 发酵培养基的灭菌,1）分批灭菌：又称间歇灭菌，是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通往蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程也称为实罐灭菌。,(分批灭菌和连续灭菌）,1）分批灭菌,优点：不需要其他设备，操作简单易行，规模 较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法。,缺点：1）加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利用率降低。2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。,分批灭菌的进汽、排汽及冷却水管路系统,1.接种管;2,4,15,17.排汽;3.进料管;5,10,12,14.进汽;6.进气管;7.冷疑水;8.冷却水进口;9.排料管;11.取样管;13.冷却水出口;16.消沫剂管;18.出气管,分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。,时间/min,温度/,50,100,150,120,80,40,160,200,240,2）连续灭菌,概念：是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭菌过的发酵罐中的灭菌方式，也称为连消。条件：在短时间加热使料液温度到灭菌温度126-132，在维持罐中保温5-8 min，快速冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。,2）连续灭菌,优点：,1)减少养分破坏，产品质量较易控制2)提高产量，缩短发酵周期3)设备利用率高，操作方便4)适于自动控制，劳动强度低,缺点：需外设加热、冷却装置，操作复杂，染菌机会多，不适合含有大量固体物料培养基的灭菌。,常见的连续灭菌的流程连消塔喷淋冷却连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程,2）连续灭菌,连消塔喷淋冷却连续灭菌流程,2）连续灭菌,物料和水,配料罐,预热罐（60-75）,灭菌器（13010-12秒）,蒸汽,维持罐（保温5-8分）,冷却水,无菌培养基,泵,泵,天冠改进后的工艺节约水25%以上,2)培养基的连续灭菌,喷射加热连续灭菌流程,T=140,闪急冷却器,薄板换热器连续灭菌流程图,2）连续灭菌,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,水 20,31,出料 35,65,进料35,100,120,维持管120,120,蒸汽147,3）固体培养基的灭菌,固体培养基少 采用常规的温热灭菌固体培养基量较大 土蒸锅：锅内温度达98以上，计时灭菌2 h，自然冷却（闷锅）。转鼓式灭菌器（酱油厂和酒厂）,1）培养基成分2）培养基成分的颗粒性3）培养基的pH4）微生物细胞的含水量,2.1 发酵培养基的灭菌,2.1.2 影响培养基灭菌的因素,5）微生物性质与数量6）冷空气排除情况7）泡沫8）搅拌,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,2.1.3 培养基灭菌时间的计算,理论灭菌时间的计算（对数残留公式）N0=2.303/k log N,K比死亡速率（s-1）NO-开始时菌浓度N-残存菌浓度 工程上，N为10-3/罐,实际灭菌的经验数据高温灭菌(High temperature setrilization)121，维持(Maintaining)20-30 min,2.1.3 培养基灭菌时间的计算,灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系阿累尼乌斯公式：K=Aexp-E/RT K菌死亡的速度常数 A阿累尼乌斯常数 exp2.71 E杀死细菌孢子的活化能（J/K mol）R气体常数8.314J/（molK)T绝对温度（K）,2.1.3 培养基灭菌时间的计算,活化能大的反应中，反应时间随温度变化也大杀死细菌和芽孢的活化能远大于营养成分被破坏的活化能（EE）,2.1.3 培养基灭菌时间的计算,采用高温短时的灭菌方法可以减少养分的破坏。,2.1.3 培养基灭菌时间的计算,采用高温短时(HTST)的灭菌方法可以减少养分的破坏。,2.2 发酵设备的灭菌,发酵设备的灭菌包括发酵罐、管道和阀门、空气过滤器、补料系统、消沫剂系统等的灭菌。通常选择0.15-0.2 MPa的饱和蒸汽，这样可以较快使设备和管路达到所要求的灭菌温度,又使操作安全。灭菌开始时，必须注意把设备和管路中的空气排尽，否则达不到应有的灭菌温度。各管路在灭菌前，要进行气密性试验，以防泄漏。,本节课小结,1 灭菌方法及原理,化学灭菌 射线灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤灭菌,2 发酵培养基与设备的灭菌,分批灭菌连续灭菌,1 发酵工业上常用的灭菌方法有（）、（）、（）、（）和（）。2 发酵生产中对培养基和设备的灭菌，以（）应用最为普遍，灭菌效果最好。液体发酵培养基的灭菌方法有（）和（）。3 高压温热灭菌时，一般常用的灭菌条件是（）；恒温干烤灭菌的条件是（）。4 分批灭菌又称为（），其过程包括（）、（）和（）3 个阶段。,本节课思考题,本节课作业题,一、名词解释 分批灭菌、连续灭菌、致死温度二、简答题1.请列出适用于发酵培养基灭菌的方法，并比较其各自的优缺点。2.简述影响培养基灭菌的因素。,本节课学习了发酵工业常用灭菌方法及发酵培养基及设备的灭菌方法，下节课将讲授无菌空气的制备，掌握发酵工业无菌空气制备的方法。,下节课讲授内容,继续学习的参考书及网站,1 李玉英.发酵工程 M.北京:中国农业大学出版社,2009.2 李艳.发酵工程原理及技术 M.北京:科学出版社,2008.3 罗大珍,林稚兰.现代微生物发酵及技术教程 M.北京:北京大学出版社,2006.4 刘振宇.发酵工程技术与实践 M.上海:华东理工大学出版社,2007.5 陈洪章.生物过程工程与设备 M.北京:化学工业出版社，2003.6 袁洽.实用消毒灭菌技术M.北京:化学工业出版社,2002.7 http:/http:/http:/,3 无菌空气的制备,第四章 发酵工业灭菌,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,3.1 发酵使用的净空气的标准3.2 空气净化的方法3.3 空气预处理3.4 介质过滤除菌的材料及原理3.5 空气净化的工艺流程,绝大多数工业发酵均是利用好氧微生物进行纯种培养，无论是生长还是合成代谢都需要消耗大量的溶解氧，用于基质同化、菌体生长和产物代谢。这些氧气的来源是空气，但空气中含有各种各样的微生物，它们一旦随空气进入发酵液，便会在适合的条件下大量繁殖，并与目的微生物竞争性消耗培养基中的营养物质，产生各种副产物，从而干扰甚至破坏预定发酵的正常进行，严重的会使发酵彻底失败，造成巨大的经济损失。空气除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一。,3 无菌空气的制备,空气除菌的意义,空气中微生物的含量和种类随地区、高低、季节空气中尘埃多少和人们活动情况而异。一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少；离地面愈高含菌量愈少；工业城市比农村含菌量多。据统计大城市空气含菌数为300010000个/m3。空气中的微生物以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母、霉菌、放线菌和噬菌体。,空气中的微生物,空气中常见的细菌大小,3.1 发酵使用的净空气的标准,不同的发酵工业生产中，不同菌种由于生产能力强弱、生长速度快慢、发酵周期长短、产物性质、培养基的营养成分和pH 的差异等，对空气质量有不同的要求，其中，空气的无菌程度是一项关键指标。发酵工业生产中应用研究的“无菌空气”，是指通过除菌处理使空气中含菌量降到零或极低，从而使污染的可能性降至极小。一般按染菌率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1次染菌。,3.1 发酵使用的净空气的标准,空气无菌程度是用空气洁净度来表示，空气洁净度是指洁净空气含尘（微粒）量多少的程度。不同生产区域（控制区和洁净区），有不同的要求。发酵使用的无菌空气除对无菌程度有要求外，还要充分考虑空气的温度、湿度和压力。,1)辐射杀菌 高能阴极射线、X射线、射线、紫外线都能破坏蛋白质活性而起到杀菌作用。其中紫外线用的较多，它在波长226.5 nm-328.7 nm时杀菌最强。一般用于无菌室、手术室杀菌。,3.2 空气除菌的方法（重点),http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,2)静电除菌,静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒，但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降所以静电除菌对很小的微粒效率很低。静电除尘法已广泛使用，除尘效率一般在8599%之间，但由于它消耗能量小，每处1000的空气每小时只需电0.20.8kw。,3)热杀菌,将空气加热到一定温度后保温一定时间,使微生物蛋白热失活而致死。热杀菌是有效的，可靠的杀菌方法，但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气，以达到杀菌目的，这是十分不经济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。,绝对过滤 绝对过滤是介质之间的孔隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气中的微生物被滤除。绝对过滤易于控制过滤后空气质量，节约能量和时间，操作简便，它是多年来受到受到国内外科学工作者注意和研究的问题。它采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5 um。介质过滤 介质过滤除菌是目前工业上用的较多的空气除菌方法，它是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。,4)过滤除菌,3.3 空气的预处理,无菌空气制备的整个过程包括两部分，一是对进入空气过滤器的空气进行预处理，达到合适的空气状态（温度和湿度）；二是对空气进行过滤处理，以除去微生物颗粒，满足生物细胞培养的需要。设备：采风塔、粗过滤器、空气压缩机、空气贮罐、空气冷却器、气液分离器、空气的加热。,一、原料,3.4 介质过滤除菌的材料及原理,棉花玻璃纤维活性炭超细玻璃纤维纸烧结材料过滤介质新型过滤介质,二、过滤除菌的原理空气除菌与液体过滤除菌的差异如棉花纤维直径一般为1620m，当充填系数为8%时，所形成的网络空隙为2050 m滤层纤维阻挡作用气流改变方向惯性冲击、阻拦、重力沉降、布朗扩散,3.4 介质过滤除菌的材料及原理,过滤除菌的原理1)布朗扩散运动直径小于1 m的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的直线运动使较小的微粒凝集为较大的微粒增加了微粒与纤维的接触滞留机会重力沉降或被介质所拦截,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,过滤除菌的原理2）静电吸引作用干空气对非导体物质（合成纤维）相对运动摩擦时，会产生诱导电荷空气中的微生物常常带有不同的电荷在介质过滤中，带电荷微生物可被具有相反电荷的介质所吸引产生相反的电荷而将粒子吸引,过滤除菌的原理,3）拦截截留作用4）惯性撞击截留作用5）重力沉降作用,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,1.压缩空气的预处理空气经压缩后具有很高的温度冷却后又具有较高的相对湿度经过空气压缩机后的空气带有油滴水滴、油滴污染空气过滤器,3.5 空气净化的工艺流程,1）压缩空气的冷却压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加发酵液水分的蒸发给培养温度的控制带来困难影响微生物生长一般用列管式冷却器进行冷却,2）除油除水大气中总含有一定量水分空气压缩后的绝对含湿量不变，当其冷却时，相对湿度增大一般用相对湿度在60%的压缩空气进行过滤除菌，不会将过滤器打湿而影响过滤效果,2.空气过滤除菌流程（1）,两级冷却、加热除菌设备流程图（参考刘艳等，发酵工程原理与技术，2007）1.粗过滤器;2.压缩机;3.贮罐;4,6.冷却器;5.旋风分离器;7.丝网除沫器;8.加热器;9.空气过滤器,1）比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能 充分地分离油水，使空气达到低的相对湿度下进入过滤器，以提高过滤效率。2）特点：两次冷却、两次分离、适当加热。3）尤其适用潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,2.空气过滤除菌流程（2）,1）利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，这样就降低了主过滤器的负荷。2）特点：采用了高效率的前置过滤设备，使空气经过多次过滤，因而所得的空气无菌程度比较高。,冷热空气直接混合式空气除菌流程（参考刘艳等，发酵工程原理与技术，2007）1.粗过滤器；2.压缩机；3.贮罐；4.冷却器；5.丝网分离器；9.空气过滤器,2.空气过滤除菌流程（3）,1、压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合。2、特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少等。3、适用于中等含湿地区，但不适合于空气含湿量高的地区。,2.空气过滤除菌流程（4）,热空气加热冷空气除菌工艺流程图（参考刘艳等.发酵工程原理与技术.2007）1.高空采风;2.粗过滤器;3.压缩机;4.热交换器;5.冷却器;6,7.析水器;8.空气总过滤器;9.空气分过滤器,利用压缩后热空气和冷却后的冷空气进行交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。,1）粗过滤器安装在空气压缩机前的过滤设备捕集较大的灰尘颗粒，保护空气压缩机布袋过滤器油浴洗涤过滤装置水雾除尘装置,2）空气贮罐消除压缩机排除空气量的脉冲，维持稳定的空气压力利用重力沉降作用除去部分油雾紧接空气压缩机安装有些装有冷却管,3）空气冷却器4）气液分离器利用离心力进行沉降的旋风分离器对于10 m以上的微粒分离效率较高一般冷凝水雾的粒子大小在10200 m填料式分离器具有较高的分离效率，可除去较细小的雾状微粒（5 m）,http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,丝网分离器,过滤除菌的关键设备空隙小于细菌、孢子：阻留作用绝对过滤介质聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3 m滤膜孔径大于微生物的过滤介质，如用棉花、玻璃纤维、合成纤维和颗粒活性炭填充的过滤器将过滤材料制成纸、板或管状，除菌效果较好,5）空气过滤器,新型过滤设备,多介质过滤器,本节课小结,发酵使用的净空气的标准空气预处理空气净化的方法介质过滤除菌的材料及原理空气净化的工艺流程,无菌空气制备,1 空气过滤除菌预处理的目的及工艺流程。2 列出空气除菌的方法，比较其优缺点。,本节思考题,本章总结,物理法,射线灭菌法,干热灭菌法,过滤除菌法,灭菌方法,湿热灭菌法,化学法,化学试剂灭菌法,培养基灭菌,发酵设备灭菌,液体培养基,连消,分批灭菌,0.15 0.2 MPa 的饱和蒸汽，空消,灭菌,固体培养基,湿热灭菌法,净化空气的标准,介质过滤除菌的材料及除菌原理,空气预处理,热杀菌,无菌空气制备,空气净化的方法,空气净化的工艺流程,辐射杀菌,过滤除菌,静电除菌,发酵工业灭菌,本章思考题,1试述培养基灭菌的主要方法及基本原理。2为什么干热灭菌与湿热灭菌相比温度高、时间长？3连消与实消相比有何优缺点？4影响培养基灭菌的因素有哪些？5工业上采用高温瞬时灭菌的理论依据有哪些。6固体培养基的灭菌方法有哪些？7根据对数残留定律，如何确定培养基的灭菌时间？8培养基灭菌过程中如何保护营养成分不受破坏而又达到灭菌的目的？9发酵使用空气净化的标准是什么？10列出空气除菌的方法，比较其优缺点，说明为什么发酵工业上采用介质过滤法。,本章继续学习的参考书（与本章相关内容）,1李艳.发酵工程原理及技术 M.北京:科学出版社,2008.2罗大珍,林稚兰.现代微生物发酵及技术教程 M.北京:北京大学出版社,2006.3刘振宇.发酵工程技术与实践 M.上海:华东理工大学出版社,2007.4李寅,高海军,陈坚.高细胞密度发酵技术 M.北京:化学工业出版社,2006.5陈洪章.生物过程工程与设备 M.北京:化学工业出版社，2003.6吴振强.固态发酵技术与应用 M.北京:化学工业出版社,2006.7熊宗贵.生物技术制药 M.北京:高等教育出版社,2005.8夏焕章,熊宗贵.生物技术制药 M.北京:高等教育出版社,2006.9袁洽.实用消毒灭菌技术M.北京:化学工业出版社,2002.,