麻风病皮肤查菌技术.ppt

麻风病皮肤查菌技术,2014年4月,麻风病的细菌学说,麻风病的病原体是麻风分枝杆菌；麻风杆菌主要侵犯皮肤、黏膜和周围神经，严重危害人类身心健康；麻风杆菌是目前已知的分枝杆菌中唯一能感染人和动物神经的菌株。麻风杆菌的体外培养尚未成功，限制了微生物学方面的研究。小鼠足垫感染等动物模型的成功，为麻风杆菌的微生物学、免疫学等研究提供了基础。,麻风流行病学,1、传染源：一般认为是未经治疗过的麻风患者。间接感染包括：土壤、污水、昆虫叮咬及经伤口皮肤感染等。2、传播途径：直接方式：皮肤接触、飞沫传播间接方式：昆虫叮咬3、易感人群：与遗传因素有关，同时更多取决于被感染者机体对麻风杆菌特异性的细胞免疫力。,麻风杆菌的基本形态,麻风分枝杆菌是杆状细菌。经抗酸染色后 菌体被染成红色 直或略弯曲 长18m，宽0.30.4m 无鞭毛，无芽胞,麻风杆菌的一般特征,麻风分枝杆菌的抗酸性 麻风分枝杆菌形态上的多形性(完整菌、非完整菌，短杆状、断裂状、串珠状、颗粒状）完整菌与非完整菌麻风分枝杆菌群族性排列,麻风分枝杆菌在体内分布,皮肤及周围神经（末梢神经、巨噬细胞、立毛肌、毛囊、皮脂腺、血管壁）粘膜（鼻、颊部、咽喉部粘膜）淋巴结LL病人在其肝、脾、睾丸能查到ML眼球前部、泪腺、巩膜、虹膜,麻风杆菌的排出途径,麻风病人破溃的皮损；鼻粘膜；瘤型病人的血、尿、便及体液中。,耐药菌和持久菌,耐药菌：对抗菌药物产生耐受能力并失去敏感性的细菌；持久菌：又称休眠菌，是指瘤型麻风在有效浓度的杀菌性抗麻风药物作用下仍然存活，并对该药完全敏感的麻风杆菌。,麻风病潜伏期,麻风杆菌侵入人体后，由于机体对杆菌感染有抵抗力，可杀灭和清除而不发病。自麻风杆菌进入人体至患者出现临床症状或体征的期间，成为潜伏期。从病原学来说，由于麻风杆菌的繁殖周期很长（对数生长期麻风杆菌世代时间平均是1113天），导致其潜伏期也较长，且发病较隐匿，较难明确潜伏期。,麻风病诊断,麻风的正确诊断是治疗和控制麻风病的重要基础。漏诊可致该病的继续传播，给患者带来更多的身心痛苦；误诊可致治疗、管理和资源上的浪费，给患者带来不必要的心理和社会压力。麻风在发生神经不可逆性损害之前的早期发现、早期治疗是及时中断传染和防治畸残发生的关键。,诊断要点：1、皮损伴明确的感觉丧失；2、周围神经粗大伴相应的功能障碍；3、皮肤涂片查抗酸杆菌（AFB）阳性；4、组织病理学检查有麻风特异性病理改变和（或）查AFB阳性。,麻风病的诊断要点之一：皮肤组织液涂片查抗酸抗菌（AFB）阳性,皮肤组织液涂片查抗酸杆菌阳性是麻风的主要体征之一。多菌型麻风的皮肤涂片、鼻黏膜拭子涂片检查均能查到AFB。,皮肤涂片特异性高,正常人鼻腔内存在非致病性非典型分枝杆菌，在现场不能通过镜检证实鼻黏膜拭子中查到的AFB是否是麻风杆菌。在鼻黏膜和鼻涕中查到AFB而无其他临床、组织学或细菌学发现时，无麻风诊断价值。因此，在进行麻风诊断时，以皮肤涂片查菌的结果更为可靠。所有各型麻风可疑病例都应进行皮肤涂片作AFB检查。,皮肤涂片敏感性低,2000年中国医学科学院皮肤病研究所报道我国19901998年发现的19453例新患者中，皮肤涂片查菌阳性者占62.9%。Saunderson等报告，在埃塞俄比亚594例新患者中，皮肤涂片阳性者占45%。故：单用皮肤涂片，敏感性较低。但是，皮肤涂片查菌结果有助于细菌学分型。,传统诊断麻风病的3个主要体征（1）皮损伴感觉丧失；（2）周围神经粗大；（3）皮肤涂片查AFB阳性。Saunderson等在2000年的报道中，对594例新患者采用传统的3个主要体征作为诊断标准进行了分析。,如果把符合3个主要体征中之一者均考虑为麻风，结果任一神经粗大者占84%皮损伴感觉丧失者占70%皮肤涂片阳性者占45%（268例），其中49%（132例）无皮损伴感觉丧失,联合应用传统标准的敏感性,WHO多菌型和少菌型麻风分类法,1981年，WHO化疗研究组将麻风分为多菌型和少菌型。多菌型(MB)：包括五级分类法中的BB、BL和LL病例，或任一部位皮肤涂片查菌细菌密度=2+者；少菌型(PB)：包括五级分类法中的TT、BT和未定类病例，或任一部位皮肤涂片查菌细菌密度2+者,麻风病复发,复发的定义：成功地完成足量联合化疗的患者，在以后的监测期或完成监测后，或在达到临床治愈标准以后，原损害再活动或加剧，或又发生新的麻风症状和体征。,复发判定标准,联合化疗复发的诊断标准中，对于多菌型麻风，其中一个标准是：在完成WHO联合化疗方案治疗2年后，皮肤涂片查菌持续阴转后，在监测期或其后又重现抗酸杆菌，且任何部位细菌密度=2+者；或在监测期或其后皮肤查菌虽未阴转，但连续2次皮肤涂片，任何部位细菌密度较前增加2+或2+以上，或有完整染色菌者。,皮肤查菌,疗效判断临床判愈复发判定,查菌阴性,不能排除诊断,查菌阳性,建立诊断,临床疑似或确诊病例的诊断与鉴别诊断,病理活检,细菌学分型,多菌型少菌型,治疗及监测方案的选择,皮肤查菌的适用范围,1、任何疑似病例，通过查菌建立或排除诊断；2、临床确诊病例，通过查菌证实诊断和分型；3、治疗开始后，监测疗效；4、复发判定，以发现是否存在耐药菌或持久菌；5、细菌学判愈。,皮肤查菌的意义,皮肤涂片查菌是诊断多菌型麻风、多菌型麻风复发、多菌型和少菌型麻风分型以及确定高菌量麻风的直接证据。皮肤涂片查菌有利于与具有相似皮损表现的其他皮肤病的鉴别诊断。皮肤涂片查菌，通过观察细菌学指数的变化来观察疗效。皮肤涂片查菌，有利于发现耐药菌和持久菌,皮肤查菌时间,1、多菌型患者通常于治疗前、治疗期间及完成治疗后，每年查菌1次，可致临床治愈；2、少菌型患者通常于治疗前、完成治疗时检查一次，以后至临床判愈前查菌1次。3、监测时当出现细菌检查阴性，隔3个月再在原来部位复查一次，如细菌检查仍然阴性，可作临床判愈。,皮肤查菌原理图,麻风 炎症 部位,皮肤查菌方法 切刮法期望得到：1、细菌密度指数2、细菌形态指数,麻风杆菌的抗酸性,指在用齐-尼抗酸染色法（简称Z-N法）染色时，麻风杆菌能被石碳酸复红染成红色，而着色后在规定条件下不能被酸性溶液（或酸醇溶液）脱色的现象。这种抗酸性可经新鲜、纯净的吡啶提取2小时而丧失，也可经过碘酸处理而恢复。是鉴定麻风杆菌的重要标准之一。,麻风杆菌形态上的多形性,皮肤涂片经Z-N法染色后在光镜下能看到着色均匀的杆状菌（完整菌），也可看到短杆状、断裂状、串珠状及颗粒状等形态的菌（非完整菌）。细菌形态与患者治疗情况有密切的关系，不规则着色的菌，有由于细菌细胞内容物部分损失所致，被认为是没有活力的细菌。,麻风杆菌群簇性排列,即在涂片中在组织细胞内外能看到麻风杆菌平行排列成束状或团状排列的特征。认为是细菌分泌的胶质或分枝菌酸等引起。,器材及试剂,麻风查菌器材：个人防护用品 消毒、止血用品 取材、涂片器材 染色镜检器材 检查记录文件试剂：抗酸染液其他：医疗垃圾袋、玻片盒,准备工作,选择光线较好的场所、避免患者面部受阳光直射；作好沟通，消除患者紧张情绪；检查取材用物品的准备情况，尤其是止血物品；载玻片编号（方法：如XC2013-1，注明涂片日期）；手术刀片、载玻片的消毒处理；取材部位的选定,皮肤查菌部位的选定,基本原则：必须真实反映病人体内麻风分枝杆菌的载荷情况,每次查菌应与首次查菌部位一致。查菌部位一般为46处（包括眉眶、耳垂、下颌、以及其他皮损部位）。具体部位选定一般临床医生根据需要来定。常规部位：眶上、耳垂及下颌 皮损应取病情最活跃处.（环状损害、斑块与结节、侵润性皮损等）,皮肤切刮涂片方法,1、用手捏紧皮损部位的皮肤，使之缺血呈苍白色；2、用手术刀片在皮损部位切一5mm左右长，23mm深达皮肤真皮层的切口；3、将手术刀转90度来回34次刮取切口边缘和底部的组织液，将刮出的组织液挑出；4、切口压迫止血；5、按取材部位顺序在洁净的载玻片上涂成57mm大小的涂膜。,取材涂片注意事项,1、取材部位要选取活动性皮损，如结节、斑块、弥漫性浸润等；2、取材的深度要够，达真皮层，刀尖要确认刮到足够量的组织液后再取出、涂片；3、组织液应不含血液；4、涂抹不宜太厚。,取材涂片注意事项,应耐心向病人解释，消除病人紧张情绪；同一病人多次取材，取材部位尽量一致；制作涂片用的载玻片确保清洁无油脂；涂抹有序排列，顺序要与记录符合；取材时应尽量避开血管；涂片制好后，自然晾干，立即固定，并应尽早染色。如不能立即染色，要妥为保存，注意防尘防霉。,CD2014-01,眉眶,2014.1.1,耳垂,下颌,皮损1,皮损2,皮损3,毛玻璃端，面向上，使用铅笔编号,涂抹区域，已印制的圆圈在底面。如不慎涂抹与此圆圈同为一面，脱色时圆圈会掉色，导致边缘着色不均或不着色。,涂片的固定,待涂片自然干燥后，酒精灯的外焰上方来回2到3次即可。不宜用火太急，否则组织液会烤焦，组织内炎症细胞收缩，细菌亦收到破坏，导致染色出现偏差。注意不要将涂片离火焰太近而将玻片烤黄或熏黑。取材后一定要及时固定。染色前再固定一次。,染色加温法,用石炭酸复红染液覆盖整个涂片，无溢出为宜；于涂片下方，外焰加热，至微微有蒸汽冒出即可；染色15分钟，中途可再加热12次；自来水洗去涂片上复红染液；用1%盐酸酒精脱色至无红色脱下为止；自来水洗去残留脱色液；用美蓝复染30秒-1分钟；自来水洗去美兰染液、晾干后镜检。,染色注意事项,1、染液要新鲜，配制后使用一般勿超过1年；2、染色要按规定的操作方法进行，也要根据涂抹的厚薄调整美蓝复染的时间长短；3、用自来水从玻片的一端轻轻冲洗，不宜直接冲洗涂抹；4、脱色15-30秒，轻轻晃动，如涂抹太厚，脱色时间稍延长或再次对某一个涂抹进行脱色操作。,染色注意事项,涂片应放置水平，复红染液应覆盖整个涂片，避免燃料干涸；加热时以微冒蒸气为宜。气温低时中途可加热23次水流宜轻缓，但要冲洗充分；不要过度脱色，以免造成假阴性。不宜使用吸水纸。染片应及时镜检，存放时间过长，细菌脱色。避免染色时损伤涂膜；,有关染色的研究,1、3种试剂处理方式对27例麻风患者组织液涂片染色效果评价（2011年）经3.5%HCL处理，背景颜色偏浅红色;经5%NaOH处理，背景颜色偏浅蓝色;经HiCN处理，背景颜色呈蓝色，与菌体呈红色的麻风杆菌对比明显。15例康复患者中4例患者报告发现麻风杆菌,菌量在+之间麻风患者皮损组织液经HiCN处理后抗酸染色可增强细菌与背景间对比效应,查菌效率优于常规染色。,2、两种抗酸染色法对麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌染色结果分析 染色符合率：,一张制作好的涂片,菌体红色、背景蓝色或浅蓝、无染液沉渣涂抹大小适中、厚薄均匀无大的空白区和大的组织残渣无霉菌或其他细菌污染无红细胞，每个视野最好平均含23各巨噬细胞,涂片镜检,麻风分枝杆菌的几种型态完整菌：菌体完整；着色均匀；两端钝圆，两侧整齐；长度为宽度的4倍以上。断裂菌：菌体着色不均匀，有一至数个淡染或空白区。颗粒菌：串珠样、竹节样、哑铃形及颗粒形镜检内容：细菌学指数（BI）形态学指数（MI）,细菌学指数分级,阴性 0条菌/100油镜视野1+110条菌/100油镜视野2+110条菌/10油镜视野3+110条菌/油镜视野4+10100条菌/油镜视野5+1001000条菌/油镜视野6+1000条菌/油镜视野,瘤型病人组织液细菌涂片（5+）,抗酸杆菌（AFB）计数方法,计数每个油镜视野中细菌数量，包括单条菌和菌球。如细菌太多，分布较均匀，可计数1/2或1/4视野后乘上2倍或4倍即为整个视野菌量。遇到菌球应大致估计一下一个菌球含多少条菌。一般大菌球含100条左右，中等大小菌球含5060条，小菌球含2030条，再小菌球则尽量直接计数。,细菌密度指数（BI）计算方法,记下每个视野菌量，把各个视野菌量相加除以检查的视野数得到平均每个视野细菌数量，即为该涂膜的细菌密度。细菌密度的计算：一个涂膜每个视野细菌总数 细菌密度=-该涂膜的观察视野数,细菌密度指数（BI）的计算,按照细菌学指数分级表，找到各涂膜细菌密度对应的分级，按一下公示计算BI：各涂膜细菌指数分级（+）的总和 BI=-涂片的涂膜数 举例：一张涂片各涂膜对应细菌指数分级分别为：眉眶（3+）、耳垂（3+）、下颌（3+）、皮损1（4+）、皮损2（4+）、皮损3（3+），其BI值应为（3+3+3+4+4+3）/6=3.33。如果，只取了常规部位和皮损1、皮损2，BI=（3+3+3+4+4）/5=3.4,查菌结果与临床各型关系如下,皮损中麻风菌数量及动态变化,皮肤中麻风菌数量视病人类型和疾病发展阶段而定，也与治疗有关。一般来说，皮肤颜色较淡，不高起、表面光滑、数量多，感觉障碍不明显的皮肤，查菌通常阳性。而皮肤高起干燥，感觉障碍明显，特别是色红，通常查菌阴性或很少。值得注意是，有些界线类病人，皮肤损害似为非活动性皮损，呈麻木萎缩，但查菌可达34个加号。,皮肤涂片中ML的数量及形态，随着病情及治疗而发生变化,经有效治疗后：细菌指数（BI）及形态指数（MI）均下降，MI下降较BI为早。LL病人的细菌指数大约每年下降0.61.0。如果下降过快，则提示原分型可能不够准确；如果下降过慢，则表明病人没有规则服药或存在耐药菌株。,不可靠的查菌结果会对病例分型及治疗带来不少问题麻风皮肤查菌质量控制,查菌假阴性时：多菌型（MB）病人可能被误诊为少菌型（PB)，病人得不到应有的治疗。如果以细菌阴转为停止服药的依据，则导致过早停药。查菌假阳性时：PB病人将按MB进行治疗，造成治疗上的浪费，延长了治疗期。,如果一个病人细菌指数下降不明显：,首先寻找原因：1）取材涂点数量是否一致？2）查菌部位是否一致？3）取材人是否同一人，导致取材有深浅差别？4）是否细菌数量仍在同一级别内，导致显示不出差别？如平均每个视野1-10条的3+判断，1-3条和4-6条以及7-10条都是3+，但数量有差别。同样11-30条，31-60条以及61-100条都是4+，但是菌量有差别。又是菌量在下降，当时从指数上看不出差别。5）确实是耐药，需要做鉴定。,如细菌下降过快，提示分型错误；如下降缓慢，提示病人服药不规则或细菌出现耐药；在界线类患者，有效治疗后细菌数量可下降很快，特别是BB和BL患者；在治疗后期的多菌型患者，细菌指数接近阴转时，细菌数量可下降特别慢，细菌密度1+可维持多年时间不阴转，此时不能认为是复发。麻风复发时密度指数常达2+以上，并能观察到完整麻风菌形态。,麻风菌的形态学意义,形态学指数对判断麻风化疗的早期疗效和治疗后的复发有意义完整菌占全部检查菌的百分率称为形态指数完整菌（S）、断裂菌（F）和颗粒菌（G）可记录为SFG百分比，与MI一样，也是监测化疗疗效的指标，且比MI更敏感。,细菌形态指数（MI）计算,各涂膜完整菌的总和 MI=-x100%各涂膜完整菌和非完整菌的总和,如果一个病人声称最近在规则服药，但在其皮肤查菌中发现大量染色完整菌，则提示病人有可能未服药或出现耐药。如果一个病人声称最近未服药，但其涂片中所有细菌呈颗粒状，则提示病人从前接受过抗麻风或接受过对麻风菌有杀伤力药物如氨基甙类或-内酰胺类药物的治疗。,查菌报告,取材结束，一定要对取材部位及时记录镜检完毕，要及时记录检查的结果报告内容：片号、患者基本信息、取材部位及相应的细菌学指数分级、计算后全片的BI值等，必要时须报告MI值，检查者签名,显微镜检查注意事项,镜检毕，染色片脱油后保存备监督复查；涂膜镜检时应严格按镜检标准进行；BI及MI记录标准在执行中要前后一致；镜下如查见形态不典型的AFB，不能确定是否为ML时，不要轻易下找到ML的结论。遇大的菌团或菌束时可根据单个细菌的大小来估计菌团菌束的细菌数量；所选视野数应尽可能地覆盖这个涂膜；阴性涂膜应增加镜检的视野数。镜检结果的记录与报告,谢谢！,祝大家生活愉快、工作顺利、身体健康！,