凝胶电泳技术.ppt.ppt

凝胶电泳技术,电泳（electrophoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。,电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类。,自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。,电泳的基本原理：在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积，即FQE。质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F6r式中r为质点半径，为介质粘度，为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：FF即QE6r 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。,电泳迁移率（m,electrophoretic mobility）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。,DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。,常用的凝胶电泳有两类：琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。,一、影响凝胶电泳迁移率的因素（一）样品的物理性质 1、分子大小 线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准确且方便。EB嵌合使迁移率下降15%。当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。,2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA，超螺旋构型）lDNA（linear form，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）ocDNA（开环DNA，open circular DNA,ocDNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口）。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。,3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5时分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。4、碱基组成：对迁移率影响不明显，单链DNA形成发夹结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA（1kb）。,(二)支持物介质（种类和浓度）,核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种线性多聚体大分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在交联剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O8，简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。凝胶浓度越小，孔径越大；浓度越大，孔径越小。,不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围,DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围,（三）电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。1-5V/cm低压时，线性DNA迁移率与电压成正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小。,高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同，凝胶有效分离范围随电压上升而下降。高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,1000-2000V（电压）,必须用PAG作介质。,（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）,1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电颗粒泳动慢；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变性）。,3、种类：TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大，易发热，长时间使用阴极为碱性，阳极为酸性，需要循环使两极的pH一致；但价格便宜，分离大片段DNA效果较好。TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强，首选TBE。TPE（Tris、磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA 易与DNA一起沉淀，影响酶反应。TNE（Tris、醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间低压电泳，分辨率高。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。,TBE一般配10 或5 的贮存液，都以1TBE作为使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5的使用液已具备足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1TBE以提供足够的缓冲容量。TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5溶液或高压灭菌。,DNA电泳条带模糊的原因（smear，涂抹状）：DNA降解，应避免核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果；建议经常更换电泳缓冲液。所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。,4)DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。5)DNA样品含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。6)有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。7)DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。,二、核酸电泳的指示剂与染色剂（一）指示剂核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，二甲苯青的迁移速率分别与2kb和1.6kb的双链线性DNA大致相似。,指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液（loading buffer）。载样缓冲液的作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内；在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置；使样品呈色，加样操作更方便。,配方：将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF或分别，或同时加入30%甘油水溶液，或40%（W/V）蔗糖水溶液，或15%聚蔗糖(Ficoll400)中。用甘油和蔗糖配制的一般要4度保存。,（二）染色剂核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染，目前还有其他安全的染色剂。,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。,由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。,染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。EB在凝胶或染色液中的浓度为0.5 ug/ml或0.1ug/ml。,注意：EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4下保存。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！核酸吸收260nm紫外线，导致DNA的断裂，因此回收DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对DNA的损伤。荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照射。,由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。(1)对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的2.5mol/L HCl，混匀，置室温数小时；加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。,（2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。,银染：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不易回收。,EB的替代物：GoldView DNA染料是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，使用方法与之完全相同。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，在某些波段甚至超过EB。在100ml琼脂糖胶溶液中加入5l GoldView即可，亦可在电泳缓冲液中以同样比例稀释后直接使用。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链多聚核酸链呈红色荧光。因此，GoldView不仅能染双链DNA，也可用于染RNA和单链DNA。GoldView DNA染料在不同的波长下灵敏度有一定影响，建议使用312nm波长。弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。,GeneFinder具有安全、灵敏等突出优点，可以代替溴化乙锭(EB)作为各种核酸电泳的染色剂。与强致癌性的EB不同，GeneFinder属于花青类染料，毒性很低，使用安全,可有效保护实验操作者和环境。GeneFinder与dsDNA 结合荧光信号可增强8001000倍，其检测核酸的灵敏度比EB染色法平均高10倍左右，与美国Molecular Probe公司的SYBR Green I染料的灵敏度相当。GeneFinder染料最大吸收峰为470nm，与该染料结合的核酸呈现绿色荧光。,GelRed TM 是美国 Biotium 公最新研制的一种出色的红色荧光核酸染色剂，适用电泳前凝胶染色和电泳后凝胶染色。与其它核酸染色剂不同，它具备高灵敏度，高稳定性，低毒性和多功能等特性。这种染色剂不仅有出色的灵敏度，而且表现出高稳定性和广泛的适应 性，可用于电泳前染色和电泳后染色。使用紫外透视器在 300nm 附近可得到最佳激发效果，在 595nm 附近 显示红色发射光谱。因此，这种染色剂可使用普遍使用的 300nm 紫外透视器得到最佳的激发光谱。,与 EB 预制凝胶不同的是，GelRed TM 预制凝胶实质上并没有本底荧光，并且对低分子量的 DNA 片段也具有极高的灵 敏度。和 EB 一样，使用 GelRed TM 制作的预制胶可以长时间贮存确不会降低性能。而 SYBRGreen 1 和 SYBR Gold 染色剂 却不具备这种特性。当 GelRed TM 用于后制凝胶染色剂时，可以在 30 分钟内完全着色，而且因为没有本底色而免去再进行一次脱色或冲洗 的过程。另外，由于 GelRed TM 的酸碱水解稳定性好，其染色剂可以批量制备以便日后使用。GelRed TM 的另一个重要特性是它比 EB 更安全，但是价格昂贵。,三、凝胶电泳的种类（一）琼脂糖凝胶（agarose gel）琼脂糖是从琼脂（agar)中分离得到，由1，3连接的吡喃型-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水-L-半乳呋喃糖组成。琼脂糖加热熔解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。,由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象高氯酸钠（NaClO4）能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。,随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶快一倍，可节省实验时间；（4）其它类型：各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离。,1、非变性聚丙烯酰胺凝胶：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。同等大小的DNA间的迁移率，由于空间结构影响可相差10%，不能用未变性的聚丙烯胺凝胶电泳判断DNA的大小。,单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis,SSCP),2、变性聚丙烯胺凝胶电泳DNA变性：加热、极端pH、有机溶剂（尿素或甲酰胺导致DNA解链）。电泳凝胶中进入变性剂：5M的尿素，使DNA为单链线性，变性DNA的移动速度与其碱基组成和序列几乎完全无关。可用于DNA序列分析等。,聚丙烯胺凝胶电泳优点：（1）分辨率高；（2）载样量大；1cm1mm的加样孔加入10 g 分辨率不下降，而琼脂糖0.5cm 1mm加样孔加入100-500ng的DNA分辨率下降。（3）回收DNA纯度高；（4）机械强度高，韧性好。,（三）脉冲电场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE),一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大，此时凝胶介质的分子筛效应不明显。DNA分子的迁移率不仅与其大小有关，而且还与电场强度有关。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。,原理：大于20kb的线性双链DNA，在琼脂糖凝胶的网孔中似蛇行或弯曲行进，不时寻找合适的空隙，恒定单向电场下易“卡住”走不动。PFGE施加在凝胶上至少有两个方向电场，时间与电流大小也交替改变，使DNA分子能够不断调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，由于DNA分子越大，在交变电场中每次重新定向所需的时间也越长，迁移率越低，从而达到分离线性大片段DNA分子。可以分离1000kb-5000kb 的DNA片段。,反转电场凝胶电泳（Field inversion gel electrophoresis，FIGE）原理同上：改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。,（四）RNA琼脂糖凝胶电泳方法同DNA，只是用变性的琼脂糖凝胶电泳，甲醛或乙二醛电泳，防止RNA二级结构的形成。关键：防止RNase的污染，一般用DEPC（0.1%）焦碳酸二乙酯。,