转基因植物制药.ppt

第三节 植物转基因技术,1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定,农杆菌介导法,基因枪法,植物转基因技术,花粉管通道法,其它方法,优点：低成本易操作、转基因的低拷贝数低、导入片段的确定性好。缺点：受作物基因型的影响较大,优点：低成本易操作、不受基因型影响、不需要经过组织培养可以获得转基因种子。缺点：导入片段的确定性差、转化效率很低。,优点：不受作物基因型的限制。缺点：成本高、转基因的拷贝数高、导入片断的确定性差,聚乙二醇法、显微注射法、激光介导法、脂质体介导法,农杆菌介导法植物转基因的原理Agrobacterium-mediated plant transformation,基因枪法植物转基因的原理Plant transformation via microprojectal bombardment,第四节 植物转基因技术,1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定,pCAMBIA1301质粒,T-Border(right),Nos 3,Gus,35S5,Nco,I,35S5,Hyg(R),T-Border(left),35S3,Hin,DIII,Sal,I,Bam,HI,Eco,RI,Bst,EII,pCAMBIA1301,11837bp,Lac Z,pCAMBIA1301,pBS-RSP1/2,35S,Hyg(R),T3 P,Gus,RSP2,LacZ,NcoI,pCAM-Gus,Bam HI,Hind III,KpnI,Bam HI,KpnI,Hyg(R),T7 P,Gus,RSP1,KpnI,BamHI,Gus,Nos3,pCAM-RSP1/2-Gus,Hyg(R),35S,35S,35S,RSP2,RSP1,KpnI,用KpnI和BamHI双酶切后连接,BamHI,Nos3,Nos3,LB,RB,(1715 bp),First intron(1182 bp),LB,LB,RB,RB,水稻蔗糖合酶基因启动子驱动Gus基因的表达载体构建,第四节 植物转基因技术,1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定,2N6诱导愈伤 7-10d,N6-BA 预培养 2-3d,种子,优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系,AB-AS 诱导12h,AB培养基活化12h,YEP平板单菌落,液体MS浸泡15min,无生长素N6-AS共培养 3d,N6-H选择培养20d,抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d,62d70d,1 2N6愈伤诱导,2 N6-BA预培养,3 N6-H选择培养,优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程,4 植株再生,第四节 植物转基因技术,1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定,2.0kb,1.0kb,0.5kb,转基因植株中Gus基因的PCR检测PCR analysis of Gus in putative transgenic plantletsM,DNA marker;P,以PCAM-Gus1质粒为阳性对照;CK1,以水为模板的阴性对照;CK2,以未转基因植株为阴性对照;1-6，转基因植株。M,DNA marker;P,PCAM-Gus1 plasmid as positive control;CK1,the templete is water as negtive control;CK2,non-transformed plantlet as negative control;1-6,putative transgenic plantlets.,M P CK1 1 2 3 4 5 6 CK2,(563 bp),转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析,A,B,C,a,b,c,a,b,c,a,b,c,A,根系；B,茎杆；C,叶片。a,Gus 基因由35S启动子驱动；b,Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动；c,未转基因水稻植株。A,roots;B,stems;C,leaves.a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively;c,no-transformed plants as negative control.,农杆菌介导的基因转移以原生质体或细胞（组织）作为受体的直接基因转移，如：聚乙二醇法（PEG）电击（EP，electroporation）脂质体（Lip，Lome）磷酸钙DNA共沉淀（CaP）微注射（Mi，Microinjection）基因枪法（particle bombardment，简称PB）超声波法（Ulstrasonication）种质系统（germ line transtormation）的基因转移，如利用子房注射、种胚以及花粉管通道等导入外源基因,植物转基因的主要方法,在当今众多的植物基因转化技术中，最为可靠和有效的方法之一是农杆菌Ti质粒介导的外源基因转化系统。这是一个本来就存在于自然界的“天然”的基因工程系统。随着人们对其机理的揭示，使人们得以利用其进行植物的定向转化把有益基因转入植物，成为可能。,概 述,1.1植物冠瘿瘤植物的一种癌症,1.1冠瘿瘤,植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。1.1.1冠瘿瘤的起因 由根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）属根瘤菌科（Rhizobiaceat）对植物的侵染而引起。1.1.2冠瘿瘤的侵染过程 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。,冠瘿瘤,上：电镜下的根癌农杆菌下：冠瘿瘤,1.1.3 冠瘿瘤的一般生物学特性,45杀死侵染植物的根癌农杆菌，植物组织仍然能形成癌。把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限止的分裂和生长。（1）根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个叫作Ti（tumor-inducing）的质粒（Ti plasmid）。（2）根癌农杆菌侵染植物后产生两种物质：类植物激素和冠瘿碱。类植物激素使细胞大量扩增，出现冠瘿瘤；冠瘿碱是受侵染植物组织合成的稀有氨基酸，包括胭脂碱、章鱼碱等。冠瘿碱是根癌农杆菌生活的C、N和能量来源。,1.2 Ti质粒,1.2.1 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95156 106D，约有200kb。最近有人发现农杆菌中还有其它的质粒，称之为隐秘质粒。稳秘质粒的功能还不清楚，有的认为可能是缺陷型的Ti质粒。迄今已从多种植物中分离出不同种类的根癌农杆菌。,1.2 Ti质粒,1.2.2 Ti质粒的物理图谱物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA上的排列顺序。Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处理之后的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分离，便可显示出有20多条大小不同的DNA酶切片段。然后将这些酶切片段进行分子杂交分析，测定顺序，再排列成完整的物理图。,1.2 Ti质粒,1.2.3 Ti质粒的基因图谱基因图谱：基因在Ti-DNA上的排列顺序。基因图谱构建：转座子标签法 利用细菌的转座子（transposon），使Ti质粒发生嵌入突变和缺失突变。细菌转座子带有各种抗菌素抗性的基因，在转化过程中它们可嵌入Ti质粒，使根癌农杆菌带有相应的抗菌素抗性，因而可方便地筛选出转座子嵌入Ti质粒突变体。由于在转座子嵌入处的编码基因发生失活，因而可通过分析Ti质粒限制性内切酶片段的变化，如某些片段消失或电泳迁移率改变，确定这些基因插入位置，并且与突变体的表型相对应，从而建立Ti质粒的基因图。目前已建立了十多个Ti质粒的基因图，其中主要是章鱼碱型和胭脂碱型两大类的Ti质粒基因图。,1.2 Ti质粒,Ti质粒的基因图谱 不同的Ti质粒有二个同源区：Vir区（转化所必须）是毒性区，也叫毒性基因或Vir基因或致病基因。TDNA（transforming DNA）TDNA是Ti质粒的转化植物的DNA，故称TDNA。在转化植物细胞二倍体基因组中含有一个或几个（至多）TDNA拷贝。noc是编码细菌利用胭脂碱的基因。,1.2 Ti质粒,1.2.4 Ti质粒的基因位点及其功能区域（1）TDNA区（transferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。,1.2 Ti质粒,（3）Con区（regions encoding conjugations）：该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始。,1.3 TDNA,1.3.1 结构：胭脂碱型的T-DNA是15kb长的DNA连续片段，占Ti 的7-15，两边有23bp的定向重复序列。章鱼碱型的T-DNA区分为两部分，左区（TL-DNA）为13kb的单拷贝序列，是诱发和维持肿瘤所必需的。右区（TR-DNA）为7kb的多拷贝序列。T-DNA通常较完整的且序列不改变地被整合到植物基因组中。,1.3 TDNA,1.3.2 T-DNA携带的遗传信息（1）致瘤基因：用于转化植物细胞的基因，使植物不受控制地繁殖致癌基因（onc基因）。（2）冠瘿碱合成酶及其分解基因：使植物细胞合成某种冠瘿氨基酸的基因。如nos（编码胭脂碱合酶的基因）和ocs（编码章鱼碱合酶的基因）,1.3 TDNA,1.3.3 Ti质粒来自细菌（原核）系统，为何其基因能在真核生物中表达？证据1.由T-DNA产生mRNA均是典型的植物mRNA分子。可通过植物RNA聚合酶II被转录，并具有5 帽子结构和3polyA尾巴。证据2.nos、ocs等基因的5末端具有真核特有的TATA-box和CAAT-box。结论：T-DNA的基因序列只能被真核生物识别，不能被原核生物识别。由此说明这些基因可以在真核细胞中表达，且只能在转化到真核细胞后表达。,1.4 Vir 区的基因结构与功能,1.4.1 Vir的位置：位于Ti质粒上T-DNA的左侧，两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异，章鱼碱型的距离较大，而胭脂碱型的间隔距离很小。1.4.2 Vir的基因结构：章鱼碱型 Ti 的Vir区：40kb，含 8个操纵子，24个基因VirA(1)、B（11）、C（2）、D（4）、E（2）、F（1）、G（1）、H（2）（PinF）、它们协同调节、形成一个调控子，共同起作用。胭脂碱型有7个操纵子。,1.4 Vir 区的基因结构与功能,1.4.3 Vir 的基因功能（1）细菌附着到植物受伤细胞上。（2）Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段，（3）T股（T Strand）被转入植物细胞，整合到寄主基因组中，（4）TDNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘤碱。,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,1.5.1 Vir基因的诱导1.5.2 VirA和VirG被结构性表达1.5.3 TDNA的加工及转移1.5.4 T-DNA链整合植物基因组,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,1.5.1 Vir基因的诱导 细菌处于易感受伤植物附近，受伤植物产生酚类物质（如烟草组织产生的乙酰丁香酮），诱导Ti 中Vir 基因的表达。章鱼碱型（ocs）Ti 质粒具有8个Vir 操纵子：VirA，VirB，irC，VirD，VirE，VirF，VirG，Vir H 胭脂碱型（Nop）有7个Vir 操纵子：VirA，VirB，VirC，VirD，VirE，VirG，Tzs,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,1.5.2 VirA和VirG被结构性表达（1）VirA 基因产物VirA蛋白，是细菌细胞膜上的疏水蛋白，是植物酚类物质如乙酰丁香酮的受体。（2）VirA蛋白与酚类物质结合，导致VirG基因产物VirG蛋白的磷酸化，VirG蛋白是个转录活化因子，其磷酸化形成一个DNA结合蛋白，能与其它Vir基因的启动子中的专一的12bp的序列结合，开启它们。因此，磷酸化把virG蛋白从非活性状态转变成活性状态。,1.5.2 VirA和VirG结构性表达,酚类,激活,VirA（膜上疏水蛋白）,VirG,VirG-P,不表达的基因,Vir活化，开始表达,转录因子与专一的12bp序列结合,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,1.5.3 TDNA的加工及转移（1）农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA 首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。（2）Vir 基因操纵子系统被活化，VirD(编码VirD1和VirD2两种蛋白，一起决定内切酶活性)表达，在边界重复序列的特定位点形成切点，产生单链断裂。,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,（3）T-DNA的复制 首先是在下链（或称底链bottom strand）25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间缺口剪切，然后从缺口3端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22碱基处，置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。,TDNA的复制,VirD蛋白的作用：（1）保护5端不被5核酸酶攻击；（2）T-DNA进入植物细胞核的向导VirE蛋白的作用：编码ssDNA结合蛋白，与单链T-DNA结合，包被T链成核蛋白丝，便于运转。,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,（4）T链复合物通过细胞膜的转运 穿膜通常需要在蛋白质N未端有一信号肽，信号肽可帮助跨越细菌内膜（IM）完成后特异肽酶切除信号肽，转运停止。T链复合物运转的活性物质可能是VirB蛋白。,VirB蛋白,按功能可将Vir B蛋白分为5类：R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体。A：可能作为能源，作为一种ATP酶促使T复合体被泵出细菌细胞。VirB11可能是这种“A”类蛋白。C：起形成通道的作用。VirB4可能是一种“C”蛋白。VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。S：载体蛋白，起运载T复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有的膜成分（内膜及周质）有关。P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。,T复合体经Vir B通道输出示意图,P.细胞结合蛋白；S.T复合体运载蛋白；C.通道蛋白；A.ATP酶；R.T复合体受体；VirD2.核定位信号；VirE2.保证T复合物在进入膜孔时不受干扰。（引自Vogel等，1992）,1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理,1.5.4 T-DNA链整合植物基因组,在靶DNA上形成一个缺刻，由于部分解旋，5-3外切酶消化形成缺口。,单链T-DNA靠近缺口，由于两链存在短的DNA 互补顺序，于是退火形成异质双链。,T-DNA末端与靶DNA连接,靶DNA链的互补链产生缺刻,以游离的3DNA末端为引物，修复合成第二条T-DNA链,2.2 植物基因工程载体种类,（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载体与微生物基因工程类同，通常是由多拷贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。（2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入TDNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。,2.2 植物基因工程载体种类,（3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。（5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，故亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统,2.2 植物基因工程载体种类,2.3.1 卸甲载体,卸甲载体：切除T-DNA上的onc基因（致瘤基因），即“解除”其“武装”的Ti载体，在这种载体中，已缺失的T-DNA部分被E.coli的一种常用载体pBR322取代。这样，任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可通过与pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到onc-Ti质粒载体上。,2.3.2共整合质粒,（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；（2）将目的基因插入该片段的适当位置，使目的基因两端带上与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。（4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。,2.3.3 双元载体,（1）双元载体，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。（2）其中之一含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。（3）两种质粒同时存在时可恢复T-DNA的转移功能。,2.3.4 载体盒,（1）所谓“载体盒”(Vector cassette)是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。（2）载体盒可以在大肠杆菌和农杆菌中保持，也易于插入到各类质粒载体、转座子或噬菌体中。,2.4.1标记基因必须具备的条件,编码一种不存在于正常植物细胞中的酶。基因较小，可构成嵌合基因能在转化体中得到充分表达检测容易，并且能定量分析,2.4.2常用的标记基因,冠瘿碱基因Gus基因(-葡糖苷酸酶基因)Cat(氯霉素乙酰转移酶基因)(GFP)绿色荧光蛋白基因,