生物化学-核酸化学ppt课件.ppt

第五章 核酸化学,NATURE|VOL485|31MAY2012,Complex shapes designed using a molecular canvas.AFM images of 100 distinct shapes.Each image is150nm-3150nm in size.,1.核酸的种类、分布与功能2.核酸的化学组成3.核酸的分子结构4.核酸的理化性质5.核蛋白与病毒,提要,核酸：当时是指从细胞核中分离出来的酸性物质。二、核酸按其所含戊糖种类不同而分为两大类：1.核糖核酸（RNA）2.脱氧核糖核酸（DNA）,第一节 核酸的种类、分布与功能,一、什么是核酸？,核糖核酸（RNA）：按功能不同分为三大类,tRNA 转运RNA（15%）rRNA 核糖体RNA（80%）mRNA 信使RNA（5%）,三、核酸的分布,原核细胞内,DNA集中在核质区RNA分散在细胞质中,真核细胞内,DNA,95%细胞核中5%线粒体及叶绿体中,RNA,75%细胞质中15%线粒体及叶绿体中10%细胞核中,四、核酸的功能,（一）DNA是主要的遗传物质是遗传信息的载体,(1).间接的证据包括：.DNA分布在染色体内，是染色体的主要成分，而染色体是直接与遗传有关的；.细胞核内DNA含量十分稳定，而且与染色体数目的多少有平行关系，体细胞(则双倍体)DNA含量为生殖细胞(单倍体)DNA含量的两倍；.DNA在代谢上较稳定，不受营养条件，年龄等因素影响；.可作用于DNA的一些物理和化学因素，如紫外线、X射线等都可以引起遗传特性的改变。,(2).直接的证据：1944年艾弗里（Avery）等人进行了肺炎双球菌的转化实验。从光滑型肺炎球菌(有荚膜，菌落光滑)分别提取DNA、蛋白质及多糖物质，并分别与粗糙型肺炎球菌(无荚膜，菌落粗糙)一起培养，发现只有DNA能使一部分粗糙型细菌转变成为光滑型，且还可以继续繁殖。而且转化率与DNA的纯度有关，DNA越纯，转化率越高。从而首次证明 遗传物质是DNA而不是蛋白质。,（二）RNA的生物学功能,tRNA 起携带和转移活化氨基酸的作用rRNA 与各种蛋白质结合构成核糖体，它 是合成蛋白质的细胞器。mRNA 是蛋白质合成的模板。,1.指导蛋白质的生物合成DNA转录形成3类主要的RNA,2.遗传物质 在病毒中RNA也是遗传物质3.具有生物催化剂功能（核酶）,第二节 核酸的化学组成,一、核酸的元素组成 基本元素：C H O N P核酸的元素组成有两个特点：1.一般不含S 2.P含量较多，并且恒定（9%-10%）。因此，实验室中用定磷法进行核酸的定量分析。（DNA9.9%、RNA9.5%）,核酸,核苷酸,水解,二 核酸的分子组成,核 酸,代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；,代表碱基,代表磷酸基,核苷酸,一、戊糖,核糖(in RNA),2脱氧核糖(in DNA),A,腺嘌呤,鸟嘌呤,（1）嘌呤,G,二.碱基,嘧啶,H3C,N,3,C,T,U,尿嘧啶,胞嘧啶,胸腺嘧啶,(2)嘧啶,RNA,DNA,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,稀有碱基,嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶都是基本碱基的化学修饰型。,鸟嘌呤,次黄嘌呤,1-甲基次黄嘌呤,胞嘧啶（C）,5-甲基胞嘧啶,三.磷酸,核酸是含磷的生物大分子。任何核酸中都含有磷酸，所以核酸呈酸性。核酸中的磷酸参与形成3，5-磷酸二酯键，使核苷酸连接成多核苷酸链。,尿苷,1,1,1,脱氧腺苷,9,四.核苷戊糖与嘧啶或嘌呤碱以C-N糖苷键连接而形成的糖苷就称为核苷，通常是戊糖的C1与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9相连接。,在核酸内，碱基与戊糖形成核苷，核苷再与磷酸形成核苷酸，许多核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接成多核苷酸链 核苷酸都是核酸的基本结构单位，它们都是5-核苷酸。（一）核酸内的核苷酸DNA主要由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP四种 脱氧核糖核苷酸组成RNA主要由AMP、GMP、CMP、UMP四种核糖核 苷酸组成,五.核苷酸,核苷酸,H2O,H2O,碱基,磷酸,戊糖,糖苷键,酯键,酯 键,（对DNA为H）,碱基连接（糖苷键）,八种核苷酸如下表所示,M-一(D-二、T三）；P-磷酸RNA的名称为某（一、二、三）苷酸，DNA在某（一、二、三）前加脱氧两字。如AMP称腺苷一磷酸(或腺苷酸）dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）。稀有核苷酸与上类似；,（二）（脱氧）核苷二磷酸、（脱氧）核苷三磷酸、双脱氧核苷酸的结构,ADP、ATP是生物体中重要的能量转换体。ddNTP在DNA的序列测定中使用,ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸),ADP,ATP,AMP,（三）环化核苷酸cAMP、cGMP：被称为第二信使，有放大激素的作用。它们在代谢调节中起重要作用。,（四）核苷酸的生物学作用（1）参与DNA、RNA的合成、蛋白质的合成、糖与磷脂的合成。（2）在能量转化中起重要作用，ATP是生物体内能量的通用货币。（3）是构成多种辅酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。（4）参与细胞中的代谢与调节（cAMP、cGMP）。,第三节：核酸的分子结构,一、DNA的分子结构（一）DNA的一级结构,1.定义：DNA的一级结构是由数量极其庞大的四种脱氧核糖核酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）按一定顺序，通过3,5磷酸二酯键连成的直线形或环形分子。2.DNA的书写顺序是53。3.DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。,3，5-磷酸二酯键,1,2,4、DNA一级结构的表示方法结构式/线条式/字母式,（1）结构式（碱基用单字母表示）,A,核苷酸,首端,末端,（2）线条式（碱基用单字母表示 磷酸基团用P表示）,（3）字母式（单字母ATGC在式中表示脱氧核苷，省略d）,二、DNA的二级结构（双螺旋）,1.定义：DNA的二级结构指DNA的双螺旋结构。,2、DNA的碱基组成特点Chargaff定律（1）所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等，（即A=T）;鸟嘌呤与胞嘌呤的摩尔含量相等，（即G=C）。碱基当量定律：嘌呤碱总量=嘧啶碱总量。（即A+G=T+C）（2）不同生物DNA的碱基组成有很大差异，可用不对称比率：A+T/G+C表示。亲缘相近的生物，其DNA的碱基组成相近，即不对称比率相近。（3）同一种生物所有体细胞DNA的碱基组成相同，可作为该物种的特征。,（1）DNA是一反向平行的互补双链结构。在双链结构中糖-磷酸骨架居外侧，而碱基位于内侧，两条链之间的碱基以氢键相结合。碱基互补配对，A=T,GC,一条链的走向为53，另一条为35。,3、双螺旋结构模型要点,其他组合易相互排斥例如 G:T,因此，DNA 的双股系藉著 A:T 和 G:C的配对关系互 相结合。,A-T配对,G-C配对,（2）DNA双螺旋为右手螺旋。螺旋直径为2nm，螺旋每旋转一周为10对碱基，螺距为3.4nm，每个碱基平面之间的距离为0.34nm,并形成大沟和小沟。,小沟,大沟,计算机模拟DNA双螺旋结构（蓝色）大沟中结合着肽（红色）,双螺旋中的大沟对于DNA和蛋白质结合时的相互识别很重要，在沟内可以辨认碱基的顺序。,4.双螺旋结构的稳定因素,DNA双螺旋在生理状态下十分稳定，结构不发生变化。稳定DNA双螺旋结构的主要作用力,1、碱基堆积力（主要因素）是双螺旋中垂直方向的作用力 2、氢键 为双螺旋中水平方向的作用力3、离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子或阳离子化合物之间所形成的盐键。,5、DNA双螺旋的类型(1)B-DNA螺旋：DNA在92%相对湿度的钠盐中的构型。标准的右手双螺旋，细胞正常状态下DNA存在的构型。(2)A-DNA螺旋：DNA在75%相对湿度的钠盐中的构型。(3)Z-DNA螺旋：左手的DNA螺旋，这种螺旋可能在基因表达的调控中起作用。(4)H-DNA螺旋：三螺旋结构，又称三链DNA(tsDNA),B-DNA&Z-DNA,三、DNA的三级结构,定义：是指双螺旋进一步扭曲形成的更高层次的空间结构，也就是比双螺旋更为复杂的构象。,线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋环状DNA形成的结、超螺旋和连环,类型,DNA的三级结构主要是指双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。超螺旋即DNA双螺旋的螺旋。,1.真核细胞染色体的DNA念珠状（线形）三级结构,超螺旋,2.原核生物以及真核生物细胞器环状DNA的超螺旋三级结构,松弛环形,正超螺旋,解链环形,松弛环形,负超螺旋,负超螺旋（右手拓扑结构）,自然界通常为负超螺旋。,RNA的一级结构是由数量极其庞大的四种核糖核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按一定顺序，通过3,5磷酸二酯键连成的线形分子，其表示方法与DNA相同。RNA的二级结构是短的，不完全螺旋的多核苷酸链。（天然RNA并不像DNA一样都是双螺旋结构，而是单链线形分子。只有局部区域为双螺旋结构。双螺旋区约占RNA分子的50%）RNA的三级结构是在茎环结构基础上进一步扭曲折叠而成的复杂结构。,四、RNA的结构,这种由单链自身折叠形成的结构称为茎环结构。茎环结构是各种RNA的共同的二级结构特征。,（一）tRNA的结构,tRNA的一级结构 1.由7493个（多为76个）核苷酸组成单链，沉降系数为4S；(沉降系数又称为沉降常数，指离心力场中沉降分子下沉的速度，1S=1x10-13秒，S常用来表示核酸分子，蛋白质分子和糖体等的大小）2.具有不变的（恒定的）核苷酸:U8、G18、G19 3.含较多的修饰核苷酸（稀有碱基）；4.5端多为PG；3端多为CCAOH（用来接受活化的氨基酸，又称为接受末端）2.tRNA的二级结构三叶草结构 具有四臂四环 3端为CCAOH 序列，5端为PG 3.tRNA的三级结构倒L形结构,tRNA的三叶草型二级结构,1,2,4,叶子,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,RNA中的碱基配对原则 A-U G-C,3,额外环,二氢尿嘧啶环,次黄嘌呤,不同的tRNA具有不同的额外环，所以额外环是tRNA分类的重要指标,假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环,tRNA的“倒L”型三级结构,（二）mRNA的结构信使RNA（messenger RNA，mRNA）不均一核RNA（heterogeneou nuclear RNA，hnRNA）：在细胞核内合成的mRNA的初级产物，经过剪接成为成熟的mRNA并移到细胞质。mRNA的功能：是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。,mRNA的成熟过程,mRNA一级结构的特点,真核生物成熟mRNA的结构特点及与原核生物的区别：1、5端帽子结构（cap sequence):m7G5ppp5Nm-5-末端的G的N7被甲基化。鸟嘌呤核苷酸焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5,5-磷酸二酯键。帽子结构能促进核蛋白体与mRNA的结合加速翻译起始速度，同时可以增强mRNA的稳定性。原核生物无此结构,mRNA的帽子结构,2、3末端多聚A的尾巴。极大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约20200个多聚腺苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。原核生物无些结构polyA的功能：1、与mRNA从细胞核转移到细胞质有关；2、与mRNA的半寿期有关，新合成的mRNA，polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短。,3、真核生物mRNA是单顺反子的，而原核生物的mRNA是多顺反子的。,顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位相当于一个基因，含有决定一种蛋白质氨基酸序列的全部核苷酸序列。多顺反子：是指携带一种以上蛋白质合成信息的mRNA也就是说：原核生物mRNA可编码几条不同的多肽链。单顺反子：只编码一条多肽链。,（三）rRNA的结构 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA），是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上。rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核糖体（ribosome）原核生物 70S真核生物 80S,rRNA的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。,16S rRNA二级结构,大肠杆菌5SrRNA的结构,（一）一般理化性质,1.为两性电解质，通常表现为酸性。,2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂。,3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。,4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。,第四节 核酸的理化性质,（二）核酸的紫外吸收性质,核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。,核酸的紫外吸收峰,天然DNA,变性DNA,纯DNA为1.8纯RNA为2.0所以用这一方法可以检测样品是否是纯品,OD260,OD280,（三）核酸的变性、复性和分子杂交一、核酸的变性,1、核酸（DNA）变性的概念：高温、酸、碱以及某些变性剂（如尿素）能破坏核酸中的氢键，使之断裂，核酸中的双螺旋区变成单链，并不涉及共价键的断裂，这一过程称为核酸的变性。监测指标为A260的变化。常用的变性方法为加热。,2、变性因素,热力强碱强酸有机溶剂变性剂射线机械力,3.变性DNA的性质 变性能导致DNA 的一些理化性质及生物学性质发生改变,溶液粘度降低溶液旋光性发生改变增色效应或高色效应,3.变性温度 通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA的熔点或熔解温度(melting temperature,Tm)。用Tm表示。DNA的Tm值一般在7085度之间。以加热为变性条件，使 DNA 分子双链解开50%所需温度,爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度狭窄性：变性温度范围很小,变性温度的特点,某些DNA的Tm值,DNA的Tm值大小与下列因素有关：（）DNA的均一性 均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围内。（）GC之含量 GC含量越高，Tm值越高，成正比关系，这是GC对比A-T对更为稳定的缘故。所以测定Tm值可推算出GC对的含量。其经验公式为：,GC（）（Tm69.3）2.44,（）介质中的离子强度 一般说来，在离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围也较窄。而在较高的离子强度的介质中，情况则相反。所以DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液中或溶液中，故常在1 molL的NaCl中保存。RNA分子中有局部的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm值较低，变性曲线也不那么陡。,1、DNA复性的概念 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火 DNA复性速度受温度的影响。复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性。如加热后将其迅速冷却至4 以下，则不可能发生复性。比Tm低25为DNA复性的最佳条件。,二、核酸的复性,三、分子杂交 定义：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成氢键，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。,核酸的分子杂交,91,DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。Southern 杂交（DNA-DNA杂交）Northern 杂交（DNA-RNA杂交，或RNA-RNA杂交）Western 杂交（抗原-抗体进行杂交）Eastern 杂交（Western bolting的变形）：双向电泳后蛋白质转移转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光。,92,核酸的变性、复性和杂交,93,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。,94,DNA的杂交：Southern印迹,95,RNA的杂交：Northern印迹,主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,96,Western 杂交印迹法(Western bloting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应,97,三种印迹技术的比较,98,原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,第五节 病毒和核蛋白,有机体内核酸常与蛋白质结合成复合体称为核蛋白体。,病毒染色体核糖体,一、病毒 病毒是由具有侵染性的核酸和蛋白质组成的。病毒是介于生物和非生物之间。病毒能使动物和植物发生多种疾病；病毒还能侵染细菌，侵染细菌的病毒称为噬菌体。病毒的核酸可以是DNA或是RNA，但是在目前已知的病毒中未发现同时含DNA和RNA的。在病毒中核酸位于病毒粒子的中心，外面包围着蛋白质，形成 衣壳（casid）病毒的侵染性是由核酸引起的，衣壳无侵染性。,烟草花叶病毒,噬菌体,噬菌体T4结构示意图,头部,颈部,尾鞘,尾丝,基板,核小体的结构,二、染色体 染色质（chromatin）特指真核细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体。,（三）核糖体,(四）核酶,核酶(ribozyme,RZ)是可作用于靶mRNA的具有催化活性的RNA，能在体外或细胞内特异性切割mRNA，阻断基因的表达。核酶通过碱基配对，特异地与靶mRNA结合，并切割分解靶mRNA。其突出的高效率、高特异性、少副作用，被誉为分子剪刀。,核酶的应用,优点：结构简单、不编码蛋白质、无免疫 原性、序列特异性、可重复使用。应用：核酶在肿瘤治疗中的作用核酶在抗病毒中的应用存在问题与展望,111,本 章 小 结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（Watson Crick双螺旋模型、ZDNA）、结构维持的化学键RNA结构与功能：碱基组成特点、RNA的种类结构及功能核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交,112,作业,1、名词解释:核酸的变性与复性、退火；DNA的熔解温度（Tm）；分子杂交,2.将核酸完全水解后可得到哪些组分?DNA和RNA的水解产物有何不同？3.对一双链DNA而言，若一条链中（A+G）/（T+C）=0.7，则：（1）互补链中（A+G）/（T+C）=？（2）在整个DNA分子中（A+G）/（T+C）=？（3）若一条链中（A+T）/（G+C）=0.7，则互补链中（A+T）/（G+C）=？（4）在整个DNA分子中（A+T）/（G+C）=？4DNA热变性有何特点？Tm值表示什么？5.DNA的二级结构有哪些特点？,113,