基因工程药物.ppt.ppt

基因工程药物,基因工程药物概论,基因工程药物含义基因工程药物是指采用基因工程技术研制的，能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以用传统方法制取的特殊药物。,一、基因工程药物种类,重组蛋白质类药物,细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体型其他：血红蛋白、白蛋白等。,核酸类药物,核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的式因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。,基因工程药物的特点,从根本上解决了某些药物的生物原料适应证不断延伸 技术含量高加速疑难病症新药物的开发,二、研制基因工程药物的关键技术,确定研制基因工程药物的技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因 组入表达载体 受体细胞高效表达 动物试验 临床试验 申报新药证书 基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书,优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。,建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。,建立基因高效表达系统,1 构建流程2 表达载体构建3 工程菌构建,基因工程大肠杆菌的构建技术,工程菌构建流程,表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定,表达载体构建,动物表达系统优点：一是哺乳动物细胞能够表达人或哺乳动物的蛋白质；二是哺乳动物细胞可对表达的蛋白质进行正确折叠、组装和糖基化等加工,生产有生物活性的产品。缺点：用转基因动物细胞生产药物成本昂贵。,转基因动物是指通过实验方法，人工地把外源基因导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使外源基因与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。,动物活体表达系统-转基因动物,1982年，R.D.Palmiter等科学家将金属硫蛋白基因的启动子和大白鼠生长激素基因拼接成融合基因，把这种基因导入小白鼠的受精卵，再将这一受精卵移植到一借腹怀孕的母鼠体内，生下来的小鼠比正常小鼠体格大一倍，称为“巨鼠”。,动物活体表达系统-乳腺生物反应器,基本方法是：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。优点：1)采用乳汁蛋白质基因的调节元件调控药物基因的表达,具有组织特异性，基因表达限于乳腺组织；2)表达产物不断随乳汁排出体外,产量高；3)与原核细胞表达系统比较，乳腺细胞具有蛋白质修饰功能，表达产物具有稳定的生物活性；4)蛋白质提取、纯化简单。,在经济效益方面，应用转基因动物乳腺生物反应器技术来制造基因药物也是一种可以获取巨额经济利润的新型产业。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。,如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。,存在问题,1)由于药物基因随机整合的位置效应会引起的表达不稳定性；2)对乳汁中蛋白质基因表达的调控机制有待深入了解，尤其是时空特异性表达及激素诱导性表达等问题须进一步探索。,动物活体表达系统-动物血液生物反应器,外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来，血细胞组分可通过裂解细胞获得。,动物活体表达系统-动物膀胱生物反应器,外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白，这种蛋白在膀胱中表达具有专一性，而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5端调控序列中，就可以指导外源基因在尿中表达。,植物表达系统,以植物作为基因工程药物表达的受体系统，目前主要用于研制转基因植物疫苗。利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白，以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马铃薯、蕃茄、香蕉等植物。利用植物受体系统表达一般蛋白质药物的研究也已开始，目前我们所认识到的中药有效成分如生物碱、皂苷、糖苷、黄酮等大部分中药是次生代谢产物，可在人工培养过程中有目的地加入已知的有效代谢中间产物、促进剂或抑制剂，增加有效成分的产量。,1、转基因植物抗虫,我国的转基因抗虫棉就是转入了 基因培育出来的。因为用化学农药防治害虫最大的危害是，因此可将具有杀虫活性的基因导入到农作物中。,Bt毒蛋白,1、转基因植物抗病毒,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,抗病毒的转基因小麦,1、转基因植物其他抗逆,抗盐碱抗干旱抗涝害抗寒抗除草剂,转基因抗除草剂玉米,转鱼抗寒基因的番茄,抗除草剂基因,抗冻蛋白基因,转基因植物：提高作物 能力，改良农作物的。,抗逆,品质,不会引起过敏的转基因大豆,1、转基因植物改良品质,转基因高赖氨酸玉米,转基因抗乙肝西红柿(中国)，虽然不能治愈乙肝，但一年只吃几个抗乙肝西红柿，就完全能代替注射乙肝疫苗。抗乙肝西红柿属于转基因食品，就是将乙肝疫苗植入西红柿内，经过多代繁殖，使转入的基因稳定化。,用转基因的植物生产药物,基因工程药物的安全性及质量检控,目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性，转基因生物有可能隐藏某些危害性。基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质量的不稳定性。在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗药性。用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正常的细胞。当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而生物活性迥异的变异体。,采取的措施：构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使其在诱导条件下才能有效表达。构建基因工程药物表达载体时慎用选择标记基因或报告基因，避免生产的基因工程药物中残留对病人有害的物资。尽可能采用外源DNA定位整合载体，避免外源DNA随机整合导致靶细胞基因突变。根据基因工程药物生产和使用的具体情况，逐步完善对此类产品的严格质量控制。,基因工程药物的质量检控,产品质量鉴定产品生物活性(效价)测定安全性评价稳定性考察产品一致性的保证,产品质量鉴定氨基酸成分分析：氨基酸序列分析、末端部分氨基酸序列分析（N端15个氨基酸）可作为基因重组蛋白质和多肽的重要鉴别指标。肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术有灵敏高效的特点，是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。重组蛋白质的相对分子质量测定蛋白质二硫键分析：对氯汞苯甲酸法和5,5二巯基双-2-硝苯甲酸法等。纯度分析,常用检测方法：杂质和污染物 检 测 方 法内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE其它蛋白杂质 免疫分析、SDS-PAGE、HPLC、CE残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸 肽谱、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化 肽谱、HPLC、质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE、IEF、HPLC、CE、质谱、凝胶过滤,杂质和污染物 检 测 方 法单克隆抗体 SDS-PAGE、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE微生物 微生物学检查支原体 微生物学检查病毒 微生物学检查,基因工程药物应用现状及发展前景,基因工程药物发展过程基因工程药物应用现状基因工程药物发展的趋势我国基因工程药物的发展状况基因工程药物专利,基因工程药物专利,一方面，生物公司自身投入巨资积极参与人类基因组、微生物基因组以及基因工程等方面的基础研究，并且不断地创新或改进与基因工程药物开发有关的产品、技术或方法，同时以申请产品专利、相关专利和依存专利的方式来保护基因工程药物的产权。另一方面，各企业之间通过合作、合并、收购等方式得到合法使用别人专利的许可，降低成本和风险,克服新药开发周期以及自身能力的限制,以研制开发更多的基因工程新药。,专利申请注意事项,应该在尚未上市之前先申请专利保护必须在合适的时间申报专利应根据专利申请和维持费用与专利获得利润之间的关系确定专利的地域性根据国内基因工程药物开发现状，可适当仿制一些技术含量高，市场潜力大的基因工程药物，但是必须根据专利法进行合法仿制,专利的含义,一是指专利权，就是指某发明人要申请得到专利法保护的权利。一是指受专利法保护的一项发明创造，是指发明人有一项发明创造已获得专利法的保护。三是专利说明书是指受保护的发明创造的详细内容，是受专利法保护的技术范围的法律文件。,在我国，专利包含发明专利、实用新型和外观设计三种类型。,专利保护的主体是指有权获得专利保护的个人和单位。它可以是专利的发明人或设计人以及他们的合法继受人和工作单位，也可是是向中国专利局申请专利的外国人。专利保护的客体是指专利保护的对象，也就是可取得专利保护的发明创造。,授予专利权的条件：具备新颖性、创造性和实用性。专利申请前须考虑的问题：1、经济效益的分析2、专利前景分析 3、专利类型的分析与选择4、不失时机地申请专利5、申请国别的选择,专利权的保护范围、期限、终止和无效,1.期限 发明专利权的期限为20年，实用新型和外观设计专利权期限为10年，均自申请日起计算2.保护范围 专利保护的是无形财产，如何确定专利保护范围，专利法规定，发明或者实用新型专利权的保护范围以其权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求。,3.终止（1）专利权期限届满自行终止（2）专利权人以书面声明放弃其专利权（3）专利权人不按时缴纳年费而终止 专利权终止后，其发明创造就成为公共财富，任何人都可利用4.无效 自授权日起满6个月内，任何单位或个人认为该专利权的授予不符合专利法规定的，都可以请求专利复审委员会宣告该专利无效。宣告无效的专利视为自始即不存在,基因工程蛋白质类药物,基因工程蛋白质类药物,细胞因子是指机体细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它们具有调节机体的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技术进行生产，用于治疗肿瘤、感染、免疫低下、造血功能障碍等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程细胞因子类药物主要有促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干扰素（IFN）、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、生长因子（GF）和凝血因子（F）等。,一、基因工程细胞因子类药物,基因重组人促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）,EPO是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素,是作用于红系祖细胞的造血生长因子，对神经元的许多功能也具有重要的调控作用。EPO是最早发现并首先运用于临床的造血生长因子，1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO)。rhEPO成为当前研究开发最成功的基因工程药物。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。EPO的产生与机体供氧状况有关，低氧可刺激EPO的产生。,EPO的分子结构和功能,天然存在的 EPO 分为两种类型,型含 35%的糖基,型含 26%的糖基。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类 EPO 含有 166 个氨基酸,相对分子质量为34 400,hEPO上有4个半胱氨酸(7,29,33,161),在7161，2933之间以二硫键相连,这对维持hEPO的生物学活性有重要作用。糖基化对稳定 EPO 的体内活性具有重要作用,若缺乏糖链,则 EPO 在体内迅速被水解而失活。,促细胞生成素的生物学作用,EPO 主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。促进系祖细胞的增殖、分化和成熟调控神经元部分功能对细胞内钙浓度也有明显的调节作用,人促红细胞生成素基因重组,天然的 hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此，在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝中克隆出 hEPO基因,并研制成功 rhEPO。1985年美国FDA 批准rhEPO作为治疗肾性贫血的药物。研制rhEPO的主要环节包括:获得人促红细胞生成素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达系统等。,hEPO基因由5个外显子（共582bp）和4个内含子（共1562bp）组成。外显子共编码193个氨基酸，包括组成信号肽的27个氨基酸。经人促红细胞生成素cDNA的克隆及其核苷酸序列的测定，hEPO基因天然的核苷酸顺序和相应的氨基酸顺序如图：,ATG GGA GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG CTG Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu-26-20TCG CTC CCT CTG GGC CTC CCA GTC CTG GGC GCC CCA CCA CGC CTC ATC TGT GAC AGC CG ASer Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg-10 信号肽-1+1 10GTC CTG GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG GCC GAG AAT ATC ACG ACG GGC TGT GC TVal Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ale 20 30GAA CAC TGC AGC TTG AAT GAG AAT ATC ACT GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAT TTC TAT GC CGlu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala 40 50TGG AAG AGG ATG GAG GTC GGG CAG CAG GCC GTA GAA GTC TGG CAG GGC CTG GCC CTG CTGTrp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 60 70TCG GAA GCT GTC CTG CGG GGC CAG GCC CTG TTG GTC AAC TCT TCC CAG CCG TGG GAG CCCSer Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro 80 90CTG CAG CTG CAT GTG GAT AAA GCC GTC AGT GGC CTT CGC AGC CTC ACC ACT CTG CTT CGGLeu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg 100 110 GCT CTG GGA GCC CAG AAG GAA GCC ATC TCC CCT CCA GAT GCG GCC TCA GCT GCT CCA CTCAla Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu 120 130 CGA ACA ATC ACT GCT GAC ACT TTC CGC AAA CTC TTC CGA GTC TAC TCC AAT TTC CTC CGGArg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Trp Ser Asn Phe Leu Arg 140 150GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACA GGG GAG GCC TGC AGG ACA GGG GAC AGA TGA（582）Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Vys Arg Thr Gly Asp Arg166（193）,获得EPO基因,构建基因组噬菌体文库克隆EPO基因血细胞中提取基因组DNABamH酶切回收酶切片段插入噬菌体EMBL3载体中构建基因组噬菌体文库PCR方法从基因组模板中扩增EPO基因片段为探针筛选完整EPO基因的插入片段克隆人工化学合成的方法获得EPO基因：对部份氨基酸序列进行修改利用PCR技术扩增EPO基因：人胎肝中提取总mRNA RT-PCR技术克隆hEPO基因,重组人促红细胞生成素的表达系统,为了获得分子结构和生物学活性与天然 EPO相似的rhEPO，选用哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统、非洲绿猴肾细胞COS7表达系统、幼仓鼠肾（BHK）细胞表达系统。目前国内外首选CHO 细胞表达系统用来表达生产rhEPO。CHO细胞表达系统：CHO细胞表达系统能准确进行转录后重组蛋白的加工修饰，表达的糖基化蛋白在分子结构和生物学活性方面与天然蛋白十分接近。CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，而表达的外源产物是胞外分泌的，这样便于产物的下游分离纯化；在CHO细胞内重组基因能高效扩增和表达；CHO细胞贴壁生长，且具有较高的耐受剪切和渗透压能力，可以进行悬浮培养。昆虫细胞表达系统、乳腺表达系统,促红细胞生成素临床应用,肾功能衰竭所致的贫血：这种病只有靠连续输血维持生命，但输血又使病人面临病毒感染和血过量的危险。EPO右刺激红细胞生成，免去慢性肾衰竭病人的输血。癌性贫血：肿瘤引起的贫血或接受化疗、放疗所引起的贫血。结缔组织病贫血：类风湿性关节炎和红斑狼疮所致的贫血。骨髓增生异常综合征贫血：促进骨髓造血状况改善。,重组人促红细胞生成素治疗的不良反应,rhEPO在治疗各种因素所引起的贫血中疗效是肯定的，并且长期应用无毒性、无器官功能障碍、无过敏反应或抗体形成。但是也存在一些副作用，最常见的是血压升高，有的疾病治疗过程中还出现静脉血栓形成、出现高钾血症、头痛、水潴留等。应该特别强调，虽然使用促红细胞生成素能提高红细胞的含量，可增强人体的机能，但长时间或大剂量使用会产生上述严重的副作用，千万不要将此药作为兴奋剂。国际奥委会早在20世纪80年代就已宣布运动员禁用EPO来提高运动成绩。但是近年来仍有一些运动员滥用rhEPO，成为运动员中最为常用的兴奋剂之一。,新型促红细胞生成素,长效红细胞生成素,新红细胞生成刺激蛋白(NESP)：是美国 Amgen 公司研制的长效 EPO 制剂,于 2001 年 6 月底获得欧洲药物评审委员会批准,用于慢性肾衰引起的贫血。NESP 是一种高糖基化 rhEPO 类似物,也是第一个被批准用于临床的新型促红细胞生成素,具有 rhEPO 相似的作用机制即刺激红系造血。NESP 含 5 个 N-糖基化位点及比 rhEPO 高 2 倍的唾液酸残基,在一级结构中多了 5 个氨基酸和 N 端另外 2 个糖基化位点,从而达到较大的代谢稳定性和3 倍于 rhEPO 的半衰期(36 h,rhEPO 为 48 h),可减少给药次数。其副作用与 EPO 相同。迄今为止尚未检测出 NESP抗体。NESP是一种安全、有效并有应用前景的新的 EPO 制剂。,EPO 融合蛋白,法国学者Dalle等,于2001 年利用基因重组技术合成了一种二聚体 EPO,由两个 EPO 及一个 9 肽连接而成的融合蛋白。实验证明无论由化学交联还是由重组 DNA 介导的编码区融合而获得的两个 EPO 分子的耦联,都能得到比天然单体更稳定,体内寿命更长的蛋白。,其他促红细胞生成素,EPO 模拟肽是Wrighton等在 1996 年采用噬菌体表面呈现技术在肽库中筛选出来的 20 肽,其相对分子质量远小于EPO 的相对分子质量,但其生物功能与 EPO 基本相同,能与 EPO 受体结合,激活后能引起一个与 EPO本身完全相同的细胞内信号机制,是一个具有潜在应用价值的小活性肽。EPO 模拟肽同天然 EPO比活性仍很低,且相对分子质量很小,直接用于表达有较大困难。采用特定的限制性内切酶位点来构建串联体,其优点在于可人为地控制串联体的大小。从理论上讲只要不超出一定范围,可构建 4 串联体、8 串联体、16 串联体等任意大小的模拟肽多聚体。,其他基因工程细胞因子类药物,干扰素药物集落刺激因子类药物白细胞介素类药物肿瘤坏死因子类药物生长因子类药物趋化因子类药物凝血因子类药物,其他基因工程细胞因子类药物,基因重组干扰素类药物 这种细胞因子作用于其它细胞时能干扰感染的病毒复制,它们是一类由哺乳动物体细胞合成和分泌的多功能糖蛋白，具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用。根据其来源一般可分为主要由白细胞产生的IFN-，几乎所有的有核细胞产生的IFN-和由淋巴细胞（T细胞）产生的IFN-三类。这三类重组干扰素基本功能相似，被广泛用于治疗多种疾病。,二、基因工程肽类激素药物,肽类激素是由内分泌腺或内分泌细胞产生和分泌的生物活性物质，经血液循环，局部弥散到相应的组织和细胞与受体特异结合发挥其调节作用，参与机体的生长、发育、生殖等多种生命活动过程。但是在特殊情况下，有些非内分泌细胞可变为内分泌细胞产生激素。其实人体的所有细胞内都存在编码这些激素的基因，都有产生激素的能力，只是有的细胞内这些基因处于沉默状态而已。,基因重组人生长激素,人生长激素(hGH)是由脑下垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种肽类激素，由191个氨基酸组成，分子量为22kD，含有两个双硫键，分别位于第53165位和第182189位的半胱氨酸之间。hGH是多功能的激素，能促进骨质生成，促进蛋白合成，促进、加速创伤愈合，提高免疫功能等。一旦体内生长激素缺乏或不足，则会导致生长缓慢，身材矮小，体质虚弱，甚至影响智力的发育。1985年开始应用重组人生长激素(rhGH)。,重组人生长激素的临床应用,治疗儿童矮小症及生长障碍治疗心功能不全治疗癌用于外科手术治疗其它疾病rhGH 治疗的不良反应和安全性最严重的是曾出现过糖尿病，特别在严重应激时可出现不可控制的高血糖症。出现的其他不良反应有水肿、头痛、关节痛、肌痛等。一般认为，在治疗上述疾病时，用合格的产品，用合适的剂量和给药方法，还是比较安全的。,其他基因工程蛋白质激素类药物,重组人胰岛素：胰岛素是胰腺中细胞分泌的一种小分子蛋白质（51肽）激素，分子量为6kD，由A链（21个氨基酸）和B链（30个氨基酸）靠两个二硫键结合组成，如果二硫键被打开则失去活性。胰岛素参与糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢的调节，具有促生长的作用，是体内一种重要的生长调节因子。体内缺乏胰岛素时，最明显的是血糖浓度升高，如超过肾糖阈，尿中将出现糖，引起糖尿病。重组人降钙素：降钙素是由甲状腺C细胞分泌产生的一种多肽类激素。临床上降钙素被用来治疗高血钙症、骨质疏松症和骨瘤病等多种疾病，具有疗效显著、副作用小的特点。,重组心钠素(ANP)：由人心房肌细胞分泌的活性多肽，具有强大的利钠、利尿、舒张血管和降低血压的作用，并能抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统，在维持机体的水盐代谢平衡中发挥十分重要的作用，可用于防治高血压、心肾功能不全等疾病。重组人甲状旁腺素：治疗骨质疏松症重组人胰高血糖素和重组人胰高血糖素样肽-1重组人促黄体素,三、重组溶血栓药物,急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓性疾病的致残率和致死率都很高,严重威胁人类生命和健康。而治疗血栓性疾病的安全有效的手段是溶血栓。临床使用的溶血栓药物有纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、葡萄球菌激酶以及水蛭素等，大部分已有基因重组药物产品。,心血管疾病中常用的抗栓及溶栓药物,抗栓药物抗栓治疗主要针对凝血酶和血小板两个环节，动脉血栓的防止应以抗血小板为主。静脉血栓的防治主要针对凝血酶。一 抗凝药物分类间接凝血酶抑制剂 普通肝素、低分子肝素，激活抗凝血酶直接凝血酶抑制剂 重组水蛭素及其衍生物凝血酶生成抑制剂 因子a、a、抑制剂等重组内源性抗凝剂 活化的蛋白C、抗凝血酶等凝血酶受体拮抗剂 凝血酶受体拮抗肽维生素K依赖性抗凝剂 华法林去纤维蛋白原制剂 去纤酶,二、抗血小板药物分类环氧化酶抑制剂 阿斯匹林联合的TXA2合成酶抑制剂和前列腺素内过氧化物受体拮抗剂血小板GPb受体拮抗剂血小板ADP受体拮抗剂 噻氯吡啶、氯吡格雷血小板Gpb/a受体拮抗剂 阿昔单抗其它,纤溶药物激活纤溶酶原形成纤溶酶，使纤维蛋白降解，溶解已经形成的纤维蛋白血栓，同时降解纤维蛋白原。第一代 尿激酶链激酶第二代 组织型纤溶酶原激活剂第三代 r-PA、TNK-tPA,尿激酶链激酶,链激酶(streptokinase,SK)进入血液循环后与血纤溶酶原(Pg)形成11的复合物,再激活纤溶酶原为纤溶酶,降解血栓中的纤维蛋白。SK作为溶栓药物主要用于临床治疗心肌梗塞、外周动脉栓塞、肺栓塞等疾病。尿激酶原(prourokinase,proUK)，作为溶栓药物给药时,保持无活性的酶原状态,只激活被纤维蛋白吸附的纤溶酶原,而对游离的纤溶酶原没有作用,也就是只在血栓表面才能活化纤溶酶原，具有较高的特异性溶血栓作用，可以克服尿激酶使用过程中非特异地激活全身纤溶系统所造成的出血问题。,组织型纤溶酶原激活剂(t-PA),t-PA能高效特异地与血栓中的纤维蛋白结合,产生的复合物激活血凝块中的纤溶酶原,产生纤溶酶,使纤维蛋白降解成可溶性产物，血块溶解,栓塞的血管重新畅通。t-PA 与纤维蛋白有极强的亲和力,t-PA 纤维蛋白复合物激活纤溶酶原的能力比游离状态的t-PA 高出100倍，而正常人血液中极少有纤维蛋白生成,所以t-PA 不会使正常人发生系统性纤溶状态。因此,t-PA 具有高效、特异的溶栓作用,是治疗栓塞性疾病的理想药物。由于与纤维酶原激活剂抑制剂(PAI)、t-PA特异性受体的作用，用t-PA溶栓治疗需要比较高的剂量，这样会增加系统性纤溶引起出血的危险。,TNK-t-PA,TNK-t-PA(Tenecteplase)是野生型t-PA cDNA 经多重突变后,由哺乳动物细胞表达生产的重组组织型纤溶酶原激活剂类产物。突变后能降低血浆清除率,延长血浆半衰期；PAI结合位点处的Lys 296、His 297、Arg 298 和Arg 299均被Ala替换,可有效地对抗PAI的抑制作用。优点:半衰期延长（是t-PA的6倍左右）,血浆清除率下降4倍,持续时间长，可单次静脉推注；对抗PAI抑制作用的能力增加了80倍,对纤维蛋白的特异性显著增强，具有更强的水解纤维蛋白的生物活性，用药剂量明显减少；治疗血栓时不出现胶原诱导的血小板凝聚,再梗塞发生率低。并且因出血等不良反应少而轻,TNK-t-PA 可5内一次性静脉用药。经期临床试验，其安全性和疗效评价与t-PA相似。,四、基因工程酶类药物,重组超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）重组端粒酶(telomerase)、重组胸苷激酶（thymidine kinase,TK）重组葡糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GC）重组蛇毒磷脂酶2(phosphlipaseA2,PLA2)重组DNA甲基化酶1(DNA methyl tranferase 1,DNMT1)重组乙酰胆碱酯酶(acetyl choline esterase,AChE)重组D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)重组基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP),基因重组超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于生物体内，是一类能催化歧化超氧阴离子自由基的金属酶，主要有含Cu和Zn的CuZn-SOD、含Mn的Mn-SOD以及含Fe的Fe-SOD。此外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD。CuZn-SOD一般存在于真核细胞的细胞浆内，但发现光合细菌中也含CuZn-SOD；Mn-SOD存在于真核细胞的线粒体和原核细胞浆；Fe-SOD存在于原核细胞内,但也有报道真核藻类及植物的叶绿体基质中也存在Fe-SOD。,SOD 能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD 能够清除自由基，此解毒反应过程是两步:第一步是，作为有害物质的超氧阴离子在 SOD 的作用下和氢离子反应，生成另一种物质过氧化氢；第二步是，过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢离反应，最终生成了一种对人体无害的物质水。SOD 临床应用：SOD对红斑狼疮、类风湿性关节炎、心肌缺血症和缺血再灌注综合症、肝病、癌病以及湿疹和皮炎(日光性皮炎、接触性皮炎、神经性皮炎)等疾病均有疗效；在临床上常用来辅助放疗和化疗以降低大剂量照射引起的副作用;并且SOD还具有抗衰老的功能，对皮肤也具有护理作用。,SOD的生物学功能及其在医药方面的应用,基因重组人CuZn-SOD,动物来源的SOD制剂存在抗原性，使用过程中往往会诱发免疫反应。目前用于生产rhCuZn-SOD的主要是大肠杆菌表达系统。修饰的rhCuZn-SOD都能提高酶整体的热稳定性，延长其半衰期。rhCuZn-SOD制品主要用于治疗新生儿氧障碍引起的呼吸系统疾病及神经系统疾病，还适用于肾移植，或作为护肤药物和治疗AIDS的辅助药物,重组端粒酶,端粒是位于真核生物染色体末端一段富含G的重复核苷酸序列。人的端粒由2501500个TTAGGG六碱基重复序列组成，细胞每分裂一次，其端粒DNA序列就丢失525bp。端粒的丢失是细胞进入衰老的标志，端粒缩短到一定长度，细胞就停止生长并衰老死亡。端粒酶是目前发现的人体内惟一由RNA和蛋白构成的具有逆转录酶活性的核糖核蛋白，人端粒酶主要包括3个部分，即人端粒酶RNA(hTR)、人端粒酶催化亚单位hTERT(hEST2)和端粒酶相关蛋白TP1(TLP1)。其中RNA组分由450个核苷酸组成，其上的结合蛋白则能指导端粒酶与染色体末端结合，并保护端粒酶免受降解破坏；hTERT是端粒酶的主要限速成分，在正常体细胞中不表达。,由于端粒和端粒酶同细胞衰老及肿瘤发生发展有密切的关系，人们设想通过重建正常体细胞端粒酶活性而延缓细胞衰老，或通过抑制端癌细胞粒酶活性而抗癌。重建正常体细胞端粒酶活性：在正常体细胞中重建端粒酶活性,弥补因细胞分裂而导致的端粒缩短，从而增强细胞增殖能力，延长细胞寿命，建立了人端粒酶相关基因的表达系统。抑制癌细胞端粒酶活性：可应用反义RNA 技术，通过抑制端粒酶mRNA以抑制端粒酶活性,达到基因治疗的目的。,五、重组可溶性受体和黏附分子,受体(receptor)指具有识别结合专一配体，介导配体发挥生物功能的一类蛋白质。以是否锚定于细胞(核)膜上为根据，把受体分为膜结合型受体和可溶性受体。可溶性受体的生物学功能有：1）作为相应膜受体的竞争者阻断配体的信号转导,2）作为血清结合蛋白转运、稳定、富集配体,3）下调膜受体数量,4）上调配体效应等。其临床应用主要是作为某些疾病的监测指标和相应细胞因子的拮抗剂。可溶性受体主要有肿瘤坏死因子受体、人白细胞介素-4受体、人促红细胞生成素受体、细胞集落刺激因子受体、成纤维细胞生长因子受体和血管内皮细胞生长因子受体等。,粘附分子(adhesion molecule,AM)是一类位于细胞膜表面的大分子糖蛋白，表达于循环白细胞和组织固有细胞表面，通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质的相互粘附，促使白细胞贴壁、外渗、游走、聚集、抗原表达和淋巴细胞激活。已发现的粘附分子按其基因家族和分子结构主要的可分为4类：即免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族和钙依赖粘附分子家族。粘附分子参与胚胎发育和分化、正常组织结构的维持、炎症与免疫应答、伤口修复、凝血与血栓形成等多种生理、病理过程，对临床治疗具有重要意义，尤其是某些粘附分子的增加可以造成肿瘤转移，因此控制粘附分子的增加，可以控制肿瘤转移。,核酸药物,核酸药物是以核酸(DNA、RNA)进入体内治疗疾病的药物，包括DNA 药物、反义RNA(antisense RNA)药物、RNA干扰(RNA interference,RNAi)药物、核酶药物和脱氧核酶药物等。,一、DNA药物,DNA药物是指直接导入靶细胞内抑制DNA复制或疾病相关基因转录，进而预防和/或治疗疾病的DNA分子或片段。目前研究得比较多的有反义寡聚脱氧核酸和三链DNA形成寡聚脱氧核苷酸。从广义讲，DNA药物还包括含药物相关基因的DNA表达载体，导入体内后，其表达产物可预防和/或治疗疾病。,反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN),一段与靶基因的mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子。能通过封闭或抑制肿瘤细胞和病毒的关键编码基因来特异性抑制肿瘤细胞增殖和病毒的复制。,作用机理,1.在DNA结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋DNA，并且位点专一性地干扰DNA和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制,作用机理,2.对ASODN进行化学改性（需要铜离子和还原剂的存在），如在ASODN的3-末端连接上化学切割试剂，可实现对靶基因的诱导切割等不可逆的反应，从而导致靶基因的失活,反义寡聚脱氧核苷酸技术,反义寡聚脱氧核苷酸技术主要包括设计合成反义寡聚脱氧核苷酸和将反义寡聚脱氧核苷酸的导入体内。设计合成反义寡聚脱氧核苷酸的原则：设计合成的反义寡聚脱氧核一般长1330nt，最好与mRNA 的关键区互补,即与5端互补,或与翻译的起始位点互补，这样对抑制目标蛋白的合成更有效。为了提高反义寡聚脱氧核苷酸对核酸酶的耐受性，往往用硫元素替换磷酸基团上的自由氧；为了增加反义寡聚脱氧核苷酸对目标序列的亲和力，可采用2-甲基核糖核苷酸修饰磷酸骨架。导入：应用阳离子脂质体作为运输载体，采用活体组织注射。,三螺旋DNA(TFO),从转录水平进行抑制，尽可能完全抑制特定基因的表达 以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶物，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录通过TFO特异性地抑制DNA上靶基因转录的技术称为反基因技术。,作用机制,合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡核苷酸在一定条件下可以与双螺旋DNA分子的同聚嘌呤&同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链DNA ODN通常结合到双螺旋中同聚嘌呤(A和G)链上,其中每个碱基与双螺旋靶区中的嘌呤碱基形成两个氢键,反基因技术的优点,特异性强，12个碱基的错配将导致三链DNA 稳定性大大降低，甚至根本不能形成三链。所需的TFO剂量小，并能